细胞生物学常用技术2

五、细胞内分子的示踪技术用一定的方法显示细胞中的分子,并对其在细胞内的代谢过程进行追踪.(一)同位素示踪技术1.原理同位素:核外电子数相同化学性质相同原子核重量不同放射性同位素:衰变,2.应用(1)条件可检测、可摄入(2)方法放射自显影（autoradiography）蛋白质-aaDNA-TRNA-U脉冲标记,A放射性物质脉冲掺入活细胞B不同时间取样切片C暗处曝光D显影、定影,胰岛素合成分泌过程,(二)抗体示踪技术,1.抗体+荧光染料光学显微镜GFP,GFP融合剪切体蛋白,2.抗体+电子致密物电子显微镜,胶体金抗体标记胰岛素,六、细胞分子生物学技术1.聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）特异性体外DNA扩增技术利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板，以dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下进行的DNA体外合成技术。,（1）反应体系：模板链DNA聚合酶dNTP引物（primer）（与模板相应序列互补）（2）反应步骤：变性94退火55延伸72,2.RealtimePCR实时定量PCR(荧光定量PCR)通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。,荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系,荧光背景信号阶段,平台期,以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。,3.核酸分子杂交(1)SouthernblottingDNA将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序列的技术.(2)NorthernblottingRNA,DNADNARNA,DNARNARNA特异性探针,A基因组DNA的消化B琼脂糖凝胶电泳分离C转膜D杂交E放射自显影,(3)原位杂交技术（insituhybridization）用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置的方法。,FISH,4.基因转移技术应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实现转入基因的扩增或表达。外源基因细菌转化真核细胞转染,基因扩增蛋白质表达,载体,(1)限制性核酸内切酶限制性内切酶：识别DNA分子内由48个碱基构成的特定序列的酶，这些酶的识别位点大多是“回文”序列。粘性末端平滑末端,(2)质粒载体克隆,(3)克隆基因的表达在细菌中的表达,在动物细胞中的表达,5.抑制基因表达技术研究基因功能及调控疾病的防治,RNA干扰技术将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。,起始阶段：双链RNA导入细胞siRNA(21-23)（shortinterferingRNAs）效应阶段：RNA诱导沉默复合物RISC解链结合mRNA（RNAinducedsilencingcomplex）（降解）,Dicer,ATP,基本原理,6.免疫沉淀技术(immuno-precipitation,IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象而发展的可以研究蛋白质相互作用的方法。研究蛋白质相互作用基本过程制备细胞裂解液抗体-凝胶颗粒或磁珠孵育细胞裂解液沉淀目的蛋白及相互作用蛋白分析SDS-PAGEWesternblot质谱,免疫沉淀过程,7.染色质免疫沉淀技术(chromotinimmunoprecipitation,ChIP)研究蛋白质与DNA相互作用的一种方法，即确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质基本过程甲醛处理细胞超声破碎染色质加入目的蛋白的抗体，形成抗体-靶蛋白-DNA复合物沉淀复合物分析DNA片段-PCR,染色质交联DNA超声处理,DNA/蛋白共沉淀交联解除,目的基因检测,七、质谱技术通过测定样品（分子被电离汽化）离子的质/荷比来进行成分和结构分析