第三章-细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法,1,1、掌握：普通光学显微镜和常用特殊光学显微镜的使用方法及其基本原理；亚细胞结构及细胞组分的分离分析方法；常用的组织细胞化学法的原理及操作技术；细胞培养和细胞工程的基本操作技术。2、了解电子显微镜和扫描隧道显微镜及相关的技术原理和方法、荧光标记技术、放射自显影技术、流式细胞仪和细胞拆合与显微操作的基本原理和方法。另外，对有关的分子生物学方法及其原理也应有所了解。,学习要求：,2,重点与难点：,1、常用显微技术的基本原理和操作方法2、亚细胞结构和细胞组分的原位显示和分离分析方法3、细胞工程的基本原理,3,4,第一节细胞形态结构的观察方法,细胞的形态观察:细胞的大小和计量单位鸵鸟卵12-15cm人卵细胞0.1mm多数细胞10-30m血细胞7m,5,人眼的分辨率0.2mm，光学显微镜的分辨率0.2m，电子显微镜可达0.2nm。,6,细胞生物学及成像技术发展史,17世纪中叶的滑竿显微镜,7,荷兰眼镜商ZacchariasJanssen制造的第一台复合式显微镜,8,RobertHooke于1670年制造的显微镜,9,现代显微镜,简洁紧凑的设计节省了镜座占用空间人机工程学设计，操作简单方便地安装各种CCD数码成像装置出色的光学性能与系统的优良品质最新的UIS2光学系统赋予显微图像前所未有的优异对比度,价格：几万至几十万元！,10,一、光学显微镜技术（lightmicroscopy),（一）普通复式光学显微镜技术,光学显微镜的组成分三部分,11,双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。,普通双筒显微镜,12,光学显微镜的成像原理,使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大10倍，另一个能放大20倍，那么整个镜片组合的放大倍数就是1020=200倍。复合显微镜中通常有两级串联放大系统，一级为物镜，另一级为目镜。,13,*对任何显微镜来说，重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。*分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。D=0.61/NSin/2其中D分辨率；光源波长；N介质折射率；物镜镜口角（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）分辨率与光源的波长、物镜镜口角和介质折射率有关。,14,应用：细胞形态的观察和组织学研究。在光学显微镜下能观察到的细胞内部结构，称为显微结构。如线粒体、叶绿体、中心体、核仁等。,光学显微镜最大分辨率=0.2m,15,光镜样品的制作：固定脱水包埋切片染色观察,甲醛、戊二醛,石蜡、树脂,1-10m,16,17,正置显微镜,倒置显微镜,正置显微镜与倒置显微镜光路比较,18,19,（二）相差显微镜(phasecontrastmicroscope),原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。应用：用于观察未染色的活细胞。,相差显微镜的光学部件及光线通路,相差：在某一时间上，光的波动所能达到的位置，便是它的相位；两组波的相位不同，即相差。,x,y,透明玻璃,产生相位差,产生振幅差,Z,有明暗之分,吸光物质,20,光线通过细胞后的变化,21,结构,聚光器或光源上增加一环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上；物镜后装有一块“相差板”，相差板上涂有特殊物质；偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品密度的不同造成的相位差起“夸大”作用；,吸光区,半透明圆环,不透明的涂漆部分,透明的环状部分,22,23,Acomparisonofgrowingyeastcellsa)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC,（三）荧光显微镜技术(fluorescencemicroscope),24,25,原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位最有力的工具。应用直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术,Specimenabsorbslightatonewavelength(theexcitationwavelength)andemitslight(fluoresces)ataspecificandlongerwavelength.Mostfluorescentdyesemitvisiblelight.,26,特点：1.利用汞灯或氙灯作为荧光激发光源，波长较短，分辨率高于普通显微镜；2.有两个特殊的滤光片：激发滤片、阻断滤片应用：对细胞内生物大分子进行定性、定位研究。,27,28,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,29,（四）激光扫描共焦显微镜技术,(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM),价格：几百万元！,30,原理：用激光作为荧光的激发光。物镜与聚光镜聚焦到同一个点，只有来自焦平面的光聚焦成像，排除漫反射和散射光。使图像清晰，提高灵敏度和分辨率。,应用：用来观察样品中荧光的分布状况，与荧光显微镜相比，图像更清晰，结合计算机软件处理，获得三维立体图像。,共聚焦显微镜的优点,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。,31,FluorescentMicroscope,Objective,ArcLamp,EmissionFilter,ExcitationDiaphragm,Ocular,ExcitationFilter,Objective,Laser,EmissionPinhole,ExcitationPinhole,PMT,EmissionFilter,ExcitationFilter,ConfocalMicroscope,32,33,蓝色为细胞核，绿色为微管,.,IsletofLangerhans胰岛,TriplelabelledisletofLangerhansextractedfromPancreas.LabelledwithFITC-anti-isnsulin（胰岛素）(green),CY3-ant-somatostatin（生长激素抑制素）(red)andCY5-anti-glucagon（胰高血糖素）(blue).,34,3colourprojectionof18opticalsectionsthroughalivingleaf.Visualisedbyauto-fluorescent.,35,36,（五）荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET),是检测活体中生物大分了纳米距离和纳米距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称FRET现象。采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于510nm。FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及作用的强弱。,37,FRET原理图,38,与融合蛋白表达检测FRET,39,（六）荧光漂白恢复技术（fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP),又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。,40,荧光脱色恢复技术（FRAP）,41,二、电子显微镜技术(electronmicroscope),（一）电子显微镜的基本知识,电镜与光镜光路图比较,42,*1.电子显微镜与光学显微镜的基本区别,波长与分辨率,43,44,电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,45,46,2.电子显微镜的基本构造,1）电子束照明系统：电子枪、聚光镜。2）成像系统：物镜、中间镜、投影镜。3）真空系统4）记录系统,电子显微镜下的图片,红细胞,蝴蝶翅膀,47,橄榄叶片,植物花粉,电子显微镜下的图片,48,49,（二）主要电镜制样技术简介,用于观察的电镜生物样品要求：超薄；更好的保持精细结构；有一定的反差,1.超薄切片技术（1）固定（2）包埋（3）切片（4）染色,电子显微镜样品的制备过程,50,莱卡超薄切片机,51,2.负染色技术,用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，凹陷处铺了一薄层重金属盐，而样品凸出的地方则没有染料沉积，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”地光亮。*负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。用于观察病毒、细菌、噬菌体、生物大分子或亚细胞碎片的结构亚单位或其三维结构。,52,肌动蛋白纤维的负染电镜照片,53,3.冷冻蚀刻电镜技术,冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。,54,冰冻蚀刻电镜照片细胞断裂面结构,4.电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,55,电镜三维重构技术,56,57,5.扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope，SEM),原理：电子枪发出的电子束被汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行扫描，电子束可激发样品表面放出二次电子。二次电子由探测器收集，转变成光电信号，控制荧光屏上的电子束强度。,JEOL扫描电子显微镜,SEM的应用,观察样品表面的形貌特征。(1)生物：种子、花粉、细菌(2)医学：血球、病毒(3)动物：大肠、绒毛、细胞、纤维(4)材料：陶瓷、高分子、粉末、环氧树脂(5)化学、物理、地质、冶金、矿物、污泥(杆菌)、机械、电机及导电性样品，如半导体(IC、线宽量测、断面、结构观察)电子材料等。,59,蛙内耳毛细胞扫描电镜投影图,特点及应用：成像具强烈的立体感，适于观察精细的立体表面结构。分辨率3nm，不能观察活的生物样品、细胞的全貌以及内部结构。,生物样品的形貌观察,疟疾破坏的两个红细胞,62,三、扫描隧道显微镜(scanningtunelingmicroscopy,STM),原理：利用量子力学的隧道效应，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品表面时，针尖和样品间产生隧道效应，并且隧道电流（I）和针尖与样品之间的间距（d）呈指数关系，这样由I可知d，即针尖的位置可以确定，由此样品的表面形貌也可确定。,装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高（侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；（4）非破坏性测量；（5）可连续成像，进行动态观察。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本（DNA、RNA、蛋白质及生物膜、病毒等）表面的结构。,63,扫描隧道显微镜具体应用,1.扫描STM工作时，探针将充分接近样品产生一高度空间限制的电子束，因此在成像工作时，STM具有极高的空间分辩率，可以进行科学观测2.探伤及修补STM在对表面进行加工处理的过程中可实时对表面形貌进行成像，用来发现表面各种结构上的缺陷和损伤，并用表面淀积和刻蚀等方法建立或切断连线，以消除缺陷，达到修补的目的，然后还可用STM进行成像以检查修补结果的好坏3.微观操作引发化学反应移动，刻写样品,65,扫描隧道显微镜下原子的镜象,中国科学院化学研究所的科技人员利用自制的扫描隧道显微镜，在石墨表面上刻蚀出来的图象。图形的线宽实际上只有10nm。,68,第二节细胞组分的分析方法,69,一、细胞的分离与纯化,动植物组织单细胞悬液混合细胞群体单一类型的细胞或细胞器,差速离心密度梯度离心,离心技术是分离细胞器及各种大分子基本手段。转速1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。超速离心机的最高转速可达100kr/min，离心力超过500kg。,二、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物,70,（一）差速离心利用不同的离心速度所产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。,原理:在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降的速度也不同，体积大的沉降的快，反之沉降的慢。,用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。,结构离心力细胞核8001000g线粒体20,000-30,000g叶绿体20,000-30,000g溶酶体20,000-30,000g微体20,000-30,000g粗面内质网50,000-80,000g质膜和光面内质网80,000-100,000g游离核糖体、病毒粒子150,000-300,000g,不同的细胞结构分离所需的离心力,72,沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。,（二）密度梯度离心,原理：用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将分离的细胞组分小心置于介质的顶部，通过离心力场的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带，从而将细胞成分分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。,74,75,1.速度沉降（velocitysedimentation）,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,76,2.等密度沉降（isopycnicsedimentation）,用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,77,密度梯度离心法与差速离心法,80,三、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法,原理：为了测定细胞组分，利用一些显色剂与被检测物质中一些特殊基团特异性结合，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。,81,DNA：福尔根（Feulgen）反应，酸解去除RNA及DNA上的嘌呤，暴露出DNA上的醛基，与Schiff试剂反应呈紫红色。RNA：Brachet反应，可被派洛宁染成红色。多糖：PAS反应，过碘酸将多糖氧化成高分子醛化合物，与Schiff试剂反应呈紫红色。,82,83,脂肪：四氧化锇反应，呈黑色；苏丹（深红色）。蛋白质：米伦（Millon）反应，呈粉红色或砖红色；重氮反应。酶：与底物共同温育，形成电子密度的沉淀物。,84,四、特异蛋白抗原的定位与定性,（一）免疫荧光技术,抗原：能刺激机体产生抗体的物质。,抗体：由抗原刺激在机体内产生，并与抗原发生特异性结合的蛋白质的总称。,多克隆抗体：由不同的B淋巴细胞产生的抗体混合物。,85,免疫荧光技术：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。利用荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。特点：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。,86,免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架,87,（二）免疫电镜技术,将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。,特点：能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,免疫电镜技术,88,89,蛋白质,聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白区带,转移,硝酸纤维素滤膜,与抗蛋白抗原的第一抗体反应,与辣根过氧化酶相连的抗第一抗体的第二抗体孵育,与底物二氨基苯胺(DAB)反应,相应条带处着色,证明有该蛋白抗原的存在,（三）免疫印迹技术,可从混合蛋白质中检测特定的蛋白质是否存在。,特点：该技术灵敏，可检测微量的特定蛋白质。,方法：,90,未标记的一抗与目的蛋白结合；洗膜去除未结合的一抗后，加标记的二抗孵育；二抗与一抗结合，洗膜去除未结合的二抗；最后加底物，二抗偶联的标记物催化底物反应产生可检测信号。,91,五、细胞内特异核酸序列的定位与定性,（一）原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法，称为原位杂交。,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,92,光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）PCR技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）,93,（二）Southern印迹技术（是体外分析特异DNA序列的方法）,提取总DNA,酶切,琼脂糖凝胶电泳,NaOH处理使双链DNA变性为单链DNA,转移至硝酸纤维素膜,与放射性标记的探针杂交,放射自显影,显示目的基因在凝胶片上的位置,Southern印迹杂交法,限制性内切酶酶切检测杂交信号提取DNA,Southern法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。,95,（三）Northern印迹技术（是体外分析特异RNA序列的方法，基本过程类似于Southern法）提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记DNA或RNA）与之杂交显影或显色检测信号。Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA,96,六、利用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态,放射性自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶感光，从而对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的技术。,97,步骤：1.用放射性同位素（如14C和3H）标记的前体分子导入生物体；2.取样制片，在切片表面涂乳胶（AgBr或Agcl）；3.经放射性曝光，放射出的电子将Ag还原成金属银颗粒，在该处形成潜在的影像；4.经显影后，使潜在的影像还原成黑色的金属银颗粒；5.定影处理后可显示黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。,98,七、定量细胞化学分析技术,（一）显微分光光度测定技术利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定这些物质（核酸、蛋白质）在细胞中的含量。紫外光显微分光光度测量法可见光显微分光光度测量法,（二）流式细胞仪（FlowCytometry）,主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,99,100,流式细胞仪分选细胞的示意图,原理：以激光作为发光源。将待测细胞用荧光染色，制成单细胞悬液。排列成单列的细胞通过激光束时，仪器可测定出标记细胞上的荧光强度；仪器使带有荧光细胞的小水滴充电；带电水滴通过高压偏转板偏离原来方向，收集细胞；未含标记的细胞或不含有细胞的水滴不偏转，从而达到分选的目的。,101,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,102,一、细胞培养（一）原核生物培养细菌培养（二）真核单细胞生物培养酵母、四膜虫（三）动物细胞培养(四）植物细胞培养,体外培养细胞必须注意三个环节：,物质营养：由培养基提供。,物质营养、生存环境和废物的排除。,103,104,体外培养的动物细胞可分为,原代细胞：是指从机体取出后立即培养的细胞，一般指培养的第2代至传10代以内的细胞。,传代细胞：是指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。,*,二、动物细胞培养,原代细胞培养步骤：胰酶或胶原酶与EDTA，将细胞从体内分离出来，在模拟体内环境的条件下，让其生存和生长。,105,有限细胞系（cellline）：细胞传至50代以后，又出现危机，不能再传下去，这种传代次数有限的体外培养细胞称为有限细胞系。,仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为,染色体改变，呈亚二倍体或非整倍性，失去接触抑制,永生细胞系：在传代过程中部分细胞发生遗传突变，带有癌细胞的特点，在培养条件下可无限传代，这种传代细胞又叫连续细胞系。,*,106,肿瘤细胞失去接触抑制行为,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,107,108,细胞克隆：利用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中选择单个细胞，并由此增殖形成具有基本相同遗传性状的细胞群体称为细胞克隆。,*,*,细胞株（cellstrain）：经生物学鉴定，具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆，称为细胞株。,体外培养细胞两种基本形态：1.成纤维样细胞2.上皮样细胞培养方式和注意点：贴壁培养悬浮培养：条件复杂，难度较大，但可获得大量细胞周期同步化无血清培养,109,110,利用植物细胞具有的全能性。,（二）植物细胞培养,主要类型：1.单倍体细胞培养雄性生殖细胞胚状体单倍体植株愈伤组织芽和根植株2.原生质体培养植物体细胞（二倍体）去壁原生质体植株原生质体融合体细胞杂交杂交植株,111,植物原生质体培养,一般采用植物的体细胞。先经纤维素酶处理去掉细胞壁，这种脱去细胞壁的细胞称为原生质体。将原生质体放在合适的培养基上，经过诱导分化可以重新长成植株。,112,3.非细胞体系在生物学研究中的作用,DNA复制RNA转录蛋白质合成细胞核装配非洲爪蟾卵去胶膜活化、裂解超离心去脂类、卵黄、色素颗粒提取物（非细胞反应体系）+外源DNA重构新细胞核,113,二、细胞工程,（一）细胞融合与细胞杂交技术,细胞融合,通过培养和诱导，两个或多个细胞融合为一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交。动物细胞融合一般用灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如聚乙二醇PEG）介导；植物细胞融合时，先用纤维素酶去掉纤维素壁。,114,115,（二）单克隆抗体技术,1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。原理：B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。,116,（三）细胞拆合与显微镜操作技术,1.细胞拆