第三章细胞生物学研究方法 3

,主讲：时丽冉,第三章细胞生物学研究方法,工欲善其事，必先利其器。论语.卫灵公第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第四节用于细胞生物学研究的模式生物,第一节细胞形态结构观察方法,一、光学显微镜技术（lightmicroscopy）二、电子显微镜技术(Electromicroscopy)三、扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope),1、普通复式光学显微镜,结构,光学放大系统：目镜与物镜,照明系统：光源、折光镜、聚光镜,机械支架系统,显微镜的结构,目镜,物镜,载物台,粗微调,光源,集光器,分辨率：能分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。,D=,0.61,Nsin（/2）,为波长，N为介质折射率，（空气为1，水1.3，香柏油1.515,溴萘为1.6），为物镜镜口角，最大为140度，Nsin/2被称为数值孔径。,2、相差显微镜,相差显微镜利用光的干涉现象将光程差或相位差转换成振幅差（物镜后装有相差板），观察活体材料及细胞器、细胞核的动态。,相位光的干涉现象和衍射现象,3、微分干涉显微镜,利用平面偏振光。偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器或大颗粒的运动,A：普通光镜下的成纤维细胞,B：相差显微镜下的成纤维细胞,C：微分干涉显微镜下的成纤维细胞,4、荧光显微镜,对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究。以超高压汞灯为光源，发射紫外光和蓝紫光，照射物体使之发出荧光，在显微镜下观察物体的形状、位置，还可观察活体。显微镜安装了激发光滤片和阻断滤片。荧光显微镜技术包括荧光素直接标记技术和免疫荧光技术。,荧光显微镜,光源,5、暗视野显微镜,根据丁达尔效应的原理设计而成，在显微镜中安装特殊聚光器，使得照明光线不能直接进入物镜，而是只允许被标本反射或折射的光线进入物镜，这样视野背景是暗的，而物体的边缘是亮的，使样品在暗的背景上显得更加突出。可观察4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。适于观察细胞的运动和外部形态，而内部结构观察不清。,暗视野显微镜,原理:利用特殊装置使照射光斜照到样品上，照射光无法进入物镜，故呈暗视野。只有从样品发出的散射光才能进入物镜被放大,在暗的背景中呈现明亮的像。,6、倒置显微镜,物镜和照明系统位置与普通显微镜相反，用于观察培养瓶或皿中的活细胞。,7、激光共聚焦扫描显微镜,物镜和聚光镜共焦点。排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率。用激光作光源，通过改变焦点获得光学切片。分辨率高，30nm，可观察立体三维结构，用于研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化。,8、荧光共振能量转移技术,检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的技术，可检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接作用（距离小于10nm）。原理：利用受体蛋白YFP能否接收供体蛋白CFP发出的荧光并被激发，测定目的蛋白的距离。例：水母素与绿色荧光蛋白。,可选择供体蛋白CFP和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达。当这两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，供体CFP发出的荧光可被YFP所吸收，并激发YFP发出黄色荧光。此时可通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光越少。反之，不会产生FRET效应。,9、荧光漂白恢复技术,使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等，检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定区域的荧光发生不可逆的淬灭。光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至漂白区来完成。例如膜脂分子或膜蛋白的流动性。,当代显微镜的发展趋势,采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体。,二、电子显微镜技术,1、电子显微镜与光镜的区别2、电镜的基本构造3、电镜制样技术,1、电镜与光镜的区别,2、电镜的基本构造,电子束照明系统,样品室,成像系统,记录系统,电子枪,聚光镜,物镜,中间镜,投影镜,真空系统,3、透射电镜制样技术,（1）超薄切片技术4050nm（2）负染技术（3）冷冻断裂和冷冻蚀刻技术（4）电镜三维重构技术,1、取材：快速、低温、体积小2、固定：保持样品的真实性。单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和四氧化锇双重固定。3、脱水：梯度乙醇或丙酮。由于常用包埋剂是非水溶性的，只有将细胞中的游离水分彻底清除之后，非水溶性的包埋剂才能渗入。,超薄切片技术,4、包埋:环氧树脂、丙烯酸树脂。脱水后将样品包埋在树脂中，使之获得一定的硬度、弹性和韧度，这样才易于切成超薄切片，并使切片能承受电子束轰击。5、切片:厚度40-50nm。在超薄切片机上进行。6、染色：染色目的：增强样品中各种结构图象之间的反差或选择性地显示某些结构或成分。染色方法：采用醋酸双氧铀（细胞核、结缔组织）柠檬酸铅（细胞质）双染法。,超薄切片技术,超薄切片技术,负染技术,某些生物样品不用切片，直接观察，如核糖体、病毒、蛋白质纤维等。此方法结果是样品本身染色很浅，而周围的载网颜色很深，将样品的精细结构衬托出来。这种染背景而不染样品的方法叫负染。用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,NegativeStainedActin,NegativeStainedActin,微丝,冷冻蚀刻电镜技术,主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。标本置于液氮或液氦中冰冻。然后低温断裂，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复型（replica）。,快速冷冻低温断裂蚀刻复型,冷冻断裂-蚀刻复型技术示意图,快速冷冻,低温断裂,断裂示意图,断裂,升华,蚀刻,铂,碳,复型,收集复型膜于载网上置电镜下观察,用金属和碳喷镀，消化样品,酵母细胞冰冻蚀刻图,电镜三维重构技术,4、扫描电镜技术,20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。CO2临界点干燥法防止样品变形的表面张力问题。,人类血细胞扫描电镜图,巨噬细胞吞噬细菌扫描电镜图,（三）、扫描隧道显微镜术,原理：应用量子力学中的隧道效应。扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。特点：1、高分辨率。横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。2、在真空、大气、液体等多种条件下工作。3、非破坏性测量。,第二节细胞组分的分析方法,一、离心技术二、细胞内各组分的显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性四、原位杂交技术五、放射性标记技术六、定量的细胞化学分析技术,一、离心技术,离心之前要先将细胞破损（研磨、超声波、匀浆器）。利用不同的细胞组分沉降系数不同将其分开。低速离心、高速离心、超速离心离心力g=1.11105Rr2沉降系数S：当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值，此即为沉降系数。1S=110-13秒,一、离心技术,差速离心：颗粒沉降速度差别在10倍以上。密度梯度离心：1、速度沉降：沉降速度有差别，密度相近。2、等密度沉降：沉降速度相同，密度不同。,差速离心,密度梯度离心,二、细胞内各组分的显示方法,利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特性，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。1、DNA的福尔根染色法紫色2、多糖的PAS染色法紫红色3、脂肪的检测4、蛋白质的检测5、酶的定性检测,三、特异蛋白抗原的定位与定性,1、免疫荧光技术抗原与抗体特异性识别，把抗体用荧光标记，通过荧光显微镜确定抗原的位置。2、免疫电镜技术免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术,四、细胞内特异核酸序列的定位与定性,原位杂交技术将核酸探针标记，核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列的位置。荧光原位杂交技术、电镜原位杂交技术。,人类染色体端粒DNA荧光原位杂交,五、放射自显影技术,利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪。常用同位素有3H、35S、14C等。包括两个主要步骤：1、同位素标记的生物大分子前体的掺入。2、细胞内同位素所在位置的显示。,六、定量细胞化学分析技术,1、流式细胞仪：定量测定某一细胞中DNA、RNA或某一特异的标记蛋白质的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的饿细胞的数量。2、显微分光光度测定技术：利用某些物质对特异光谱吸收的原理，测定这些物质在细胞中的含量。,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,一、细胞培养1、动物细胞培养2、植物细胞培养3、非细胞体系的应用二、细胞工程1、细胞融合与细胞杂交2、单克隆抗体技术3、核移植4、显微操作技术,什么叫细胞培养及意义？,1、在无菌条件下，把动物或植物细胞从有机体分离出来，放在器皿中，给予适当的营养物质和培养条件，使细胞能继续生长和生存的方法。2、意义：理论意义、实践意义。,1、动物细胞培养,药物,营养,10代,悬浮细胞,培养瓶,贴壁生长,有丝分裂,单细胞层,动物细胞,原代细胞的培养,首先从健康动物取出组织块，剪碎，用胰酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）等将细胞连接处消化分散，给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内pH）,在培养瓶中进行静止或慢速转动培养。不论用何种培养液，一般都要加一定量的小牛血清，这样才有利于细胞的贴壁生长与分裂。,动物原代细胞培养步骤,原代细胞（primarycell）,传代细胞（sub-culturecell）,将肌体取出的细胞或组织进行实效培养。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。,原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。用于传代培养的称为传代细胞。,原代细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能渡过“危机”而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传代40-50次，并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞称为细胞株。,细胞株（cellstrain）：,一般情况下，当细胞株传至50代以后又要出现“危机”，不能传下去。但如有部分细胞发生了遗传突变，并带有癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传下去，这种传代细胞称为细胞系，细胞系细胞的特点是染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，容易传代培养。如Hela细胞系、BHK21细胞系、CHO细胞系等。,细胞系（cellline）：,2、植物细胞培养,相对动物细胞培养要容易，不仅能形成愈伤组织，还能形成完整植株。单倍体细胞培养：用花药直接培养原生质体培养,二、细胞工程,细胞培养是基础1、细胞融合与细胞杂交2、单克隆抗体技术3、细胞拆合与显微操作技术4、核移植,1、细胞融合与细胞杂交,(1)两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象(2)方法：用灭活的仙台病毒或PEG或用电融合方法(3)不同基因型细胞融合后的情况核型不稳定，染色体丢失。,2、单克隆抗体技术,1975年，英国的Kohler和Milstein建立单克隆抗体技术，被称为免疫学的重大技术革命，1984年获诺贝尔奖。,抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞通过基因重排有合成一种抗体的遗传基因。单克隆抗体的基本概念：单克隆是指所有制备抗体的细胞都相同。产生的抗体叫做单克隆抗体。,2、单克隆抗体技术,单克隆抗体技术的基本原理：1、B淋巴细胞的特点：能分泌抗体。但不能在体外增殖。2、骨髓瘤细胞特点：可在体外无限生长繁殖。不产生抗体。缺乏通过旁路合成DNA的酶。3、应用细胞融合技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性。用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备单克隆抗体。,2、单克隆抗体技术,3、细胞拆合与显微操作技术,细胞拆合：研究核质互作。显微操作：在显微镜下利用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射，如直接将DNA注射入细胞核，或利用基因枪技术可获得转基因动植物。,4、核移植（克隆技术）,将体细胞的核移植到去核的卵细胞中的繁殖技术。,约翰格登的青蛙核移植实验,4、核移植（克隆技术）,1962年，牛津大学的约翰格登用来自蝌蚪肠道的成熟分化细胞的细胞核替换掉了卵细胞内不成熟的细胞核，这一修改后的卵细胞最终仍发育成一只正常的蝌蚪。蝌蚪分化细胞的细胞核在移植进入卵母细胞质中后，能指导卵细胞发育为性成熟的成体青蛙。“这是世界上首次证明成熟的细胞核在一定情况下可以逆转为原始状态。”约翰格登在实验中所使用的体细胞核移植技术通常被称为克隆技术。,1996年第一例克隆哺乳动物在以威尔.穆特教授为首的罗斯