细胞生物学方法

医学细胞生物学的研究方法,显微技术生物化学与分子生物学技术细胞分离技术细胞培养与细胞杂交,一、显微技术,显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。,普通光学显微镜,光镜样本制作显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。分辨率是指区分开两个质点间的最小距离,荧光显微镜,细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位最有力的工具。,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,激光共聚焦扫描显微镜,蓝色为细胞核绿色为微管,激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。,暗视野显微镜,照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。,相差显微镜,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。,一种介壳虫的染色体,微分干涉差显微镜（DIC),优点是能显示结构的三维立体投影影像，使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。,倒置显微镜,用于观察培养的活细胞,透射电子显微镜,1932年Ruska发明了以电子束为光源，用电磁场作透镜的电子显微镜。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍透射电子显微镜扫描电子显微镜,工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。,RER的形态,显微操作/注射仪,二、生物化学与分子生物学技术,细胞化学技术组织化学或细胞化学染色：是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,免疫细胞化学根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法酶标记的称为酶标免疫法,显微光谱分析技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定,放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，组织中的放射性即可使乳胶感光。显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。,分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。,Southernblot,PCR技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。,PCRCycle：,STEPS,Denaturation:DNAstrandsseparate.94oC,Annealing:PrimersbindtoDNA.65-40oC,Extension:NewDNAissynthesized.72oC,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交,最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。,三、细胞分离技术,离心技术流式细胞术细胞电泳,离心技术差速离心,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,用差速离心法分离已破碎的细胞各组份,A等速度沉降，B等密度沉降,离心技术密度梯度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。用于精细组分或生物大分子的分离。,流式细胞术流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计。,细胞电泳在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动的现象称为细胞电泳。引起细胞电泳的电位值称为电位。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞电荷量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同，因此可用来分离不同种类的细胞。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的电位。电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。,四、细胞培养与细胞杂交,细胞培养选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。细胞融合通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交。,动物细胞培养,群体培养（左）和克隆培养（右）,基本原理,1、细胞融合的概念：在自然条件下或用人工方法使两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。2、人工诱导方法：应用最广泛的是聚乙二醇3、可能的作用机制：聚乙二醇可引起细胞膜中的磷脂的酰键及极性基团两者在结构上发生重排。,植物细胞培养,1、组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株。2、悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。3、原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体。4、单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。,正常淋巴细胞具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,JEM-1011透射电子显微镜,JEOL扫描电子显微镜,图2-3荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）图片来自/,激光共聚焦扫描显微镜,AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)und