SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，14.4-97KD）1电泳各试剂的配制1.1 凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，2.67%C)为聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide 29.2 g、双丙烯酰胺NN-bis-methylene-acrylamide 0.8 g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。4避光储存。1.2 即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。 1.5M Tris-HCl，pH 8.8称取Tris base 18.15 g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH 8.8，再加去离子水至总体积100mL。4储存。 0.5%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝0.5g，去离子水定容至100mL。 0.5M Tris-HCl，pH 6.8：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH 6.8，再加去离子水至总体积100mL。4储存。 10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。1.3 凝胶配制按下表比例配制凝胶水/mLAcr/Bis（30%）/mL1.5M Tris-HCl，pH 8.8/mL0.5M Tris-HCl，pH 6.8/mL10%SDS/mL12%分离胶3.44.02.50.15%浓缩胶5.71.72.50.1分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。临灌胶前，往分离胶中加入100 l 10%APS及10 l TEMED；往浓缩胶中加入100 l 10%APS及20 l TEMED（各试剂按比例增减）。其中：TEMED为催化剂1.4 10电极缓冲液，pH 8.3称取Tris base 30.3 g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS 10.0 g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。4储存。临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。1.5 样品溶解液S去离子水 3.55mL； 0.5M Tris-HCl，pH 6.8 1.25mL；glycerol （甘油 ） 2.5mL10% (w/v) SDS 2.0mL0.5%（w/v）溴酚蓝 0.2mL总体积为9.5 mL。室温储存。临用前加50 l -巯基乙醇（-Mercaptoethanol）于950 l 样品缓冲中，即为样品溶解液。2 染色各试剂的配制2.1 固定液：50%乙醇，12%冰醋酸，0.1%甲醛（即250ml无水乙醇+60ml冰醋酸+0.5ml甲醛+去离子水至500ml）2.2 洗涤液：50%乙醇（500ml无水乙醇+500ml去离子水）2.3 敏化液：0.02%无水硫代硫酸钠（62.78mg五水硫代硫酸钠，加去离子水定容至200ml）2.4 染色液：0.5% 硝酸银，0.075%甲醛（临用现加）（0.5g硝酸银+100ml去离子水+197ul甲醛）甲醛临用现加2.5 显色液：6%无水碳酸钠，0.0004%硫代硫酸钠，0.05%甲醛（临用现加）（即60g无水碳酸钠+6.28mg五水硫代硫酸钠+去离子水至1000ml作为显色贮备液，每次用时取100ml+132ul甲醛即得）2.6 终止液：50%乙醇，12%冰醋酸（250ml无水乙醇+60ml冰醋酸+去离子水至500ml即为终止液）以上均用去离子水配制。3 针晶提取3.1 取新鲜天南星科药材，去皮。3.2 切碎至约3 mm2。3.3 将已切碎的药材置于大小适宜的洁净研钵中，加入2倍体积石油醚（6090）研磨，每次约510 min，反复多次。3.4 将石油醚溶液倒出，经4层医用纱布过滤，合并滤液，用孔径0.22 m的偏氟膜抽滤，得滤饼。3.5 取滤饼适量于离心管中，加入30倍体积的四氯化碳，混匀，8000 rpm 离心3min（三楼），去除四氯化碳液，反复3次。3.6 离心后的下层沉淀中加入石油醚（6090）适量，混匀，用孔径0.22 m的偏氟膜过滤，得滤渣，即为毒针晶蛋白纯化的样品。4 实验步骤4.1 样品制备 精密称取半夏及其它样品纯化毒针晶蛋白适量，分别以移液枪加入样品溶解液，使浓度为30 l/mg混匀（，将各样品液及未预染标准蛋白于沸水浴中加热5 min后，置于高速离心机中，10000 rpm离心3 min（五楼）。4.2 上样 精密吸取各样品液10 l、标准蛋白液5 l，按电泳仪使用说明中的上样方法上样。4.3 电泳 设置电流强度为：浓缩胶10 mA、分离胶16 mA。4.4 固定 将胶从玻璃板中取出，切角标记。放置适宜容器内，以固定液固定，平稳放置摇床上，室温下固定1 h以上。4.5 清洗 将固定液倾倒出，加入洗涤液，反复洗涤3次，每次5 min。4.6 敏化 将洗涤液倾倒出，加入敏化液，敏化1min。4.7 清洗 将敏化液倾倒出，加入去离子水，反复洗涤3次，每次1 min。4.8 染色 将去离子水倾倒出，加入染色液，避光染色20 min。4.9 清洗 将染色液倒出，加入去离子水，反复洗涤3次，每次1 min。4.10 显色 将去离子水倒出，加入显色液，先荡洗片刻后除去，再次加入显色液，注意