BDNF与脑缺血的研究进展

BDNF与脑缺血的研究进展付美红 李海涛*（南京中医药大学药学院,南京 210009）摘要：脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor , BDNF）是在脑内形成的一类神经营养因子。BDNF通过作用于其特异性受体TrkB、P75促进神经元的生长发育同时修复受损的神经元。BDNF对缺血性脑损伤的保护机制是通过下调钙离子浓度，减小Bax/Bcl-2比值，对抗NO毒性等途径实现的。本文介绍了BDNF的基本作用，及其与脑缺血的相关作用研究，综述了将BDNF的应用方法研究。关键词：BDNF,；作用机制；脑缺血；应用研究Advances in the research of BDNF with cerebral ischemia FU MeiHong,LI HaiTao*College of Pharmacy,Nanjing Uiversity of Chinese Medicine ,Nanjing,210009,ChinaAbstact:Brain derived neurotrophic factor (BDNF) is a class of neurotrophic factor formed within the brain. BDNFpromote the growth and development of the neurons and repair the damaged neurons act on its specific receptors TrkB and P75.BDNF plays a key role in Ischemic damage protection mainly by eliminating oxygen-derived free radicals,Reducing Bax/Bcl-2 ratio,regulating the low levels of ca2+ and against NO toxicity as well. This paper introduces the basic function of BDNF and the related research of BDNF on Ischemic damage.The article review the research of the application methods of BDNF.Key words:BDNF；mechanism；cerebral ischemia；Application researchThis study is supported byThe Science and Technology Development Fund of Macao 脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor , BDNF）是在脑内合成广泛分布于中枢神经系统内的一种蛋白质。中枢神经系统发育过程中，BDNF对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用。BDNF能够促进受损伤神经元再生及分化，促进受损神经元的修复，防止神经元受损死亡。在脑缺血后神经损伤具有明显的作用。脑缺血后内源性的BDNF的分泌及分布存在着一定的规律，侧脑室注射外源性的BDNF 对脑缺血损伤具有明显的保护作用。外源性的BDNF不易透过血脑屏障，限制了其临床应用。本文介绍了BDNF的基本作用，及其与脑缺血的相关作用研究，综述了将BDNF更好的应用抗脑缺血的方法研究。1.BDNF的作用机制研究BDNF促进神经元胞体发育,刺激胞体发出突起和对突起延伸的作用，对神经元的生存、生长、分化和可塑性有重要影响。在成体,则表现出广泛的神经营养和神经保护作用,对神经元的存活、正常生理功能的维持及损伤后的修复有着积极的意义。最新研究发现内源性的BDNF的分泌及作用存在嵌套自放大反馈信号机制1：海马神经细胞通过分泌BDNF，激活细胞质cAMP和PKA活性，进一步激发细胞BDNF自分泌，促使TrkB向海马神经元膜表面插入。同时BDNF/TrkB信号激活PI-3k，促进受体TrkB囊泡运输，进一步地增强了局域的BDNF/TrkB信号。这两步嵌套自放大反馈信号机制放大的BDNF信号确保了局域cAMP/PKA活性稳步升高，在轴突发育和生长中发挥关键性的作用。BDNF 可以经胞体顺行运输至轴突末端并释放, 被次级神经元摄取和利用,参与突触可塑性。JNK相互作用蛋白3能够介导TrkB顺轴突转运调节BDNF诱导的Erk激活以及轴突中丝状伪足的形成2。BDNF通过与神经元轴突末梢膜上的受体TrkB和 P75结合,逆行运输至胞体发挥生物学作用。TrkB是BDNF的特异性受体，分为全长受体和截断受体。BDNF与其特异性受体TrkB结合同时激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）MAPKErK通路及(磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI-3K)PI-3KAKT信号通路来发挥其对缺氧神经元的保护作用3。在大多数情况下MAPK途径是BDNF发挥作用的优势途径，对细胞存活起着重要的调节作用。BDNF激活MAPKERK通路,在CAMP反应元件结合蛋白(CREB)的丝氨酸位点激活CREB。CREB通过增加 BDNF基因及抗凋亡蛋白基因 BCL-2的表达, 来促进神经细胞生存, 增加突触可塑性及神经发生。而PI-3-KAKT信号通路的激活则不仅发挥促存活效应,而且对幼稚神经元的轴、 树突极性的建立及神经元的迁移也起到一定的作用4。BDNF通过以上方式促进神经元的的轴性生长及连接,介导神经元的存活,并参与对各种神经元应激的反应。同时诱导神经前体细胞的定向分化 ,加快神经元迁移,促使神经元增生,确保神经系统的成熟和完善。 P75受体则为 BDNF低亲和力蛋白受体,是富含络氨酸的糖蛋白，但不具备络氨酸激酶活性，是肿瘤坏死因子超家族的成员之一。主要起诱导神经元胞体凋亡和介导神经再生的抑制作用。BDNF的前提物质是潜在的凋亡因子，其机制可能与其作用于P75受体介导细胞的凋亡有关。P75NTR 可以调节轴突生长的长度。非结合状态的 P75NTR通过 RhoA信号通路来调节轴突延伸，而结合状态的 P75NTR可以终止RhoA通路。有活力的神经元在轴突发育中可通过促进p75受体介导轴突退化从而消除那些活力差的神经元。在退化的神经元中P75受体较为丰富,其通过抑制 TrkA 介导的信号传导来引起神经元退化。Singh6等发现发育中的轴突可以被 BDNF-p75NTR调节，在发育中的交感神经轴突的竞争中， BDNF以活动依赖性的方式分泌，同时结合 p75NTR，引起神经的退化，最终，轴突被终止生长。有研究发现激活P75受体能够促进在新生儿脑中NMDAR兴奋性毒性介导的细胞凋亡5。2、BDNF及其受体在脑缺血损伤后的表达规律近年来多种研究发现无论短暂性或持续性脑缺血均可诱导内源性 BDNF表达增加 ,提示这可能是一种内源性自我保护机制。缺血后大鼠大脑内皮质、海马、缺血灶周围BDNF 的表达存在一定的规律：BDNF表达成阶段性的增高3d后增高，7 d 后其表达水平继续增强达高峰, 30 d 后 BDNF 阳性细胞数量及表达水平降低7-8. Bjot Y 9等研究发现脑缺血损伤后全脑BDNF升高尤其在损伤的半脑去增加明显，缺血4h,24h后损伤半球的神经细胞和室管膜细胞均有BDNF染色。在损毁半球的周围神经细胞和室管膜细胞，小胶质细胞（于缺血后24小时），血管内皮细胞的脑动脉（在缺血后4小时和24小时）和星形胶质细胞均存在着较强的BDNF染色。脑缺血后 BDNF的特异性结合受体表达也存在着一定的规律10： 在成年大鼠大脑中动脉（MCA）闭塞模型中有以下现象：（1）梗死核心出现脑源性神经营养因子（BDNF）和其全长受体TrkB的永久性减少（2）在大鼠中动脉阻塞12h后在内部区域边缘（半影区）出现BDNF的免疫反应暂时性增加（3）增加在梗死区周围的星形胶质细胞截断型TrkB受体的免疫反应；（4）大鼠中动脉堵塞后24和48小时后同侧和对侧的分散的神经元全长TrkB的免疫反应增加。BDNF在海马各区的表达也存在着一定差异10：研究发现缺血耐受区域CA3、 CA4以及齿状比缺血敏感区CA1的BDNF的表达相对高出许多。说明脑缺血后 CA3、 CA4 区以及齿状回可通过自身代偿, 调节内源性的 BDNF 表达, 从而提高神经元抵抗缺血的能力,促进受损神经元的修复、 再生, 调节神经结构的重建,同时也表明其对缺血损伤较敏感, 具有反应迅速、 作用持久的保护机制。3、BDNF抗脑缺血损伤的作用研究脑缺血后BDNF及其受体的时空分布与脑缺血耐受程度相关性说明BDNF对脑缺血具有保护作用。BDNF的作用研究近年亦越来越受到人们的重视。研究发现在缺血后大鼠侧脑室注射BDNF反意寡核苷酸组织BDNF的表达后脑缺血大鼠接受恢复训练，结果显示大鼠的脑缺血损伤行为并没有恢复。以此推测BDNF在术后的脑缺血损伤的恢复过程中起到重要的作用12。后期有研究发现脑缺血后恢复过程中需要一定量的BDNF，只有当脑内BDNF含量到达一定阈值损伤大脑能够恢复13。大量药理实验研究发现BDNF对脑缺血损伤具有保护作用：Takeshima Y14研究证实连续脑室给BDNF能够在不影响脑血流的情况下，减少大脑皮层细胞凋亡，缩小梗死面积。以此推断BDNF对脑缺血就有明显的保护作用。动物实验证实脑室注射BDNF对大鼠脑缺血再灌注损伤均有一定的保护作用。永星15等在脑缺血再灌注6，12h后经侧脑室注射BDNF。发现脑组织SOD活性明显增强，MDA含量明显降低。中脑皮层神经细胞的凋亡指数均明显降低。对脑组织超微结构的观察发现：未给药组的缺血侧脑皮层神经细胞染色质浓缩、 集聚或边集化，部分崩解，胞质肿胀、扩张 ，线粒体肿胀 ，线粒体嵴断裂甚至消失。部分凋亡细胞裂解成小碎片，由膜结构包裹部分细胞核和细胞质而形成凋亡小体；而BDNF给药各组缺血侧脑皮层神经细胞超微结构损伤改变不大或仅有轻微改变 ,胞质相对比较均匀 ,染色质轻度聚集 ,核仁存在 ,线粒体结构基本正常或仅轻微改变。Saarelainen16曾对缺乏 BDNF 基因的小鼠进行研究,发现其梗死灶面积明显大于对照组, 而提高内源性BDNF水平可明显缓解脑缺血后的神经元损伤程度, 提示脑缺血后 BDNF反应性增强是机体早期神经元对缺血、 缺氧自我保护的一个重要内容。4、BDNF抗脑缺血损伤的作用机制研究 脑缺血后存在各种损伤机制：钙离子超载引发的一系列反应，自由基增多，兴奋性毒性，NO的产生等。兴奋性毒性、 梗死周围去极化、 炎症和细胞凋亡发生在4 个不同时间点 ,但有重叠并互相联系是脑缺血后的损伤级联反应17。已有许多研究证实BDNF 针对脑缺血损伤的各种机制均存在着一定的作用1、减轻钙离子超载：BDNF 调节细胞膜上钙离子通道蛋白的表达而影响钙离子流：通过神经肽的表达来维持细胞内钙的稳态以减少神经元的葡萄糖缺失的损伤18；2、抗自由基损伤, 增加超氧化物岐化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等在神经元内的含量，提高其活性及刺激细胞的修复19；3、下调 NMDA 受体功能,抑制谷氨酸的毒性204、BDNF 可以对抗 NO 供体的细胞毒,从而保护神经元免受损伤。由BDNF受体的作用机制发现，BDNF的神经修复作用主要是通过 TrkB受体产生，而p75受体主要起诱导神经元胞体凋亡和介导神经再生的抑制作用。已有实验证明脑缺血损伤中也存在 p75 NTR 的表达增高，阻断其信号可以延缓病情发生和促进细胞存活BDNF 与 Trk- B相结合。研究发现21预注射BDNF给药组的新生小鼠缺血缺氧后海马组织中Trk- B mRNA表达水平与模型组相比明显增高，Trk- B受体的活性增强，而p75 mR-NA明显降低。BDNF 能够调控TrkB受体的表达分布，使受体的含量增高，易于激活。同时BDNF本身能够激活其特异性受体发乎生物学作用。通过减小Bax/Bcl-2比值能够抑制脑缺血后的神经元细胞凋亡也能够对脑缺血起到保护作用：Schbitz22等研究发现局灶性脑缺血发作后静脉滴注BDNF治疗的动物缺血半暗带的凋亡前蛋白Bax阳性神经元明显减少而抗凋亡蛋白 ( BCL - 2)阳性神经元显着增加。Bax属于促进凋亡的蛋白，而Bcl-2能够阻止细胞色素c从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡。以此推测BDNF通过减小Bax/Bcl-2比值抑制脑缺血后的神经元细胞凋亡对脑缺血发挥保护作用。5、BDNF抗脑缺血损伤的应用研究 从上述各种研究不难发现对于脑缺血保护作用研究均为经侧脑室注射对脑缺血起到很好的保护作用，但是BDNF作为一种天然的蛋白分子，难以通过血脑屏障发达到临床应用效果。经静脉注射BDNF对脑缺血损伤几乎没有任何作用。BDNF不易透过血脑屏障因而限制了其在临床上的应用。BDNF应用于临床应该探索新的方式。以下为BDNF的应用研究。 （一）形成易于通过血脑屏障的融合蛋白：层粘连蛋白在中枢神经系统的细胞外基质分布很多尤其在缺血区表达更多。将层粘连蛋白结合域（LBD）与BDNF融合构造层粘连结蛋白BDNF（LBD-BDNF）。发现LBD -BDNF可以特异性结合层粘连蛋白和保持源性神经营养因子在体外和体内活性LBD-BDNF治疗能够减少MCAO后神经毒性，也减少梗死体积同时改善神经功能23。Frankel、 Pabo、等24发现来源于人免疫缺陷病毒的TAT蛋白能够跨膜导入细胞内部,TAT蛋白分子内部内部的高度碱性区（氨基酸49-57），富含较多的正电荷，与跨膜密切有关因而被称为蛋白质转导结构域（PTD）。PTD可与多种全长蛋白质或多肽类形成融合蛋白，这些蛋白质的分子量可从10-120kDa，包括卵血清蛋白、辣根过氧化物（horseradish peroxidase，HRP），细胞周期蛋白激酶抑制剂p27Kipl等。另外，PTD不仅能携带蛋白质进入动物体内组织细胞，而且可保证所携带蛋白质的生物活性25。把PTD置于BDNF的氨基（N）端或羧基（C）端，皆可使BDNF通过BBB。通过基因重组技术可以制得保持BDNF活性又易通过BBB的PTD-BDNF融合蛋白26。 PTD-BDNF具有神经营养活性,静脉注射给小鼠后能穿越血脑屏障，对淀粉状蛋白 （Amyloid -） 致培养海马神经元的损伤有保护作用。研究发现27PTD-BDNF融合蛋白经静脉给药后能通过血脑屏障发挥神经保护作用,减轻脑缺血再灌注损伤,改善神经功能。 （二）将BDNF导入合适载体细胞进而移植入靶点治疗。刘勇等28通过构建 BDNF反转录病毒载体感染骨髓间充质干细胞后，发现基因修饰后细胞大量表达分泌 BDNF，并且经维甲酸诱导后分化为神经细胞，免疫组织化学检测到神经元特异的表面标志。因此设想若能将 BDNF-干细胞基因工程干细胞移植入缺血损伤脑内，不仅干细胞本身可以替代损伤及凋亡的神经元，并能通过旁分泌作用促进周围组织细胞的修复再生，以达到双重治疗功效。Kazuhiko 等29的研究也证实他们的猜测。Kazuhiko 应用BDNF腺病毒载体感染干细胞，移植大鼠脑后发现BdNF-干细胞移植后表达及分泌的 BDNF 量比单纯移植干细胞高23倍，移植714 d 后 BdNF-干细胞组功能恢复明显高于对照组，MRI显示梗死范围亦明显小于对照组。也有愈多研究证实30BDNF修饰后的神经干细胞移植治疗缺血性脑损伤能够增强其对脑缺血损伤的保护作用。（3） 将BDNF 包裹形成缓释制剂应用于临床：由于神经细胞的损伤往往是一种持续的病理过程，BDNF对于神经损伤的作用不仅要达到有效的局部浓度，还要考虑有效浓度能维持足够长的时间。因此在结局其血脑屏障通过率的问题的同时还必须解决其有效浓度的维持问题。药物缓释系统能长时间释放药物，消减峰谷现象，减少给药次数。利用药物缓释系统，单次注药即能长期释放药物，维持一定的浓度，有利于发挥药效。壳聚糖/海藻酸钠微囊及是近年发展的具有良好生物相容性、无毒 、无副作用的一种新的药物缓释系统，有良好的应用前景。聚糖/海藻酸钠微囊可以部分保护蛋白类药物免受胃酸和消化道酶的降解 , 提高药物的生物利用度。研究发现在体外包裹BDNF 的壳聚糖/海藻酸钠微囊中的BDNF以零级速率释放具有药物缓释作用31。有研究证实32玻璃体腔内注射包裹 BDNF 的壳聚糖/海藻酸钠微囊能长期释放药物对受损的神经节细胞起到了明显的保护作用。据此我们可以将BDNF包裹于壳聚糖/海藻酸钠微囊中应用于抗脑缺血损伤。这将是一个很好的应用方式。同时将BDNF制成缓释注射纳米粒也能够达到药物缓释的效果。有研究者采用乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为载体材料，复乳化溶剂挥干法制备载有BDNF的PLGA纳米粒包裹性好、包封率高33。 (四) 药物及刺激提高内源性的BDNF的表达。现有许多传统中药对脑缺血的作用研究发现：许多中药中对脑缺血保护作用的机制是通过提高内源性的BDNF的产生。复方麝香注射液有明显促进 BDNF 含量增加的作用,并使其作用时间延长34。醒脑解毒汤能上调大鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑组织中 BDNF、 GDNF mRNA表达，改善急性期缺血性中风大鼠脑组织的缺血情况35。夏天无36可通过调节CRP和BDNF的表达发挥脑神经保护作用从而使脑梗死大鼠的脑组织病理形态改善，对脑梗死模型大鼠起到治疗作用。电针( EA)、经颅磁刺激( rTMS)以及EA 结合rT MS 改善缺血性脑梗死患者神经功能，有研究证实37EA 结合rTMS 能够提高海马区BDNF的表达从而对脑缺血后损伤的神经元起到修复作用.6.讨论 BDNF是现今研究最多的神经营养性物质，受到许多研究者的关注。脑缺血损伤后BDNF代偿性的增高，形成脑缺血额后的自身保护机制。现今对于脑缺血损伤的药物治疗研究中，许多神经保护剂的临床应用研究效果均不好，迫切的需要探索出新的方法。侧脑室注射BDNF对脑缺血损伤具有很好的保护作用，但是BDNF的静脉注射和口服给药对脑缺血的保护作用很差。如何将BDNF更好的应用在临床中是我们迫切需要解决的问题。通过转基因的蛋白融合技术制作PTD-BDNF和LBD-BDNF，BDNF修饰后的神经干细胞移植等是现在BDNF应用研究的主要方法。已有实验研究证实这两种方式均能够对脑缺血损伤起到保护作用。BDNF修饰的细胞移植要应用于临床还需克服许多技术上的难题。通过转基因的蛋白融合技术制作PTD-BDNF和LBD-BDNF应用于临床是相对比较方便的方式。但是其缺点在于制作方式复杂，制作技术复杂。将药物包裹与药物缓释系统制作方式简单，且药物作用持久是将BDNF应用于临床的更好的选择。此外增加内源性的BDNF来对抗脑缺血损失也是一个较好的选择。参考文献1Cheng PL, Song AH, Wong YH, et.al.Self-amplifying autocrine actions of BDNF in axon development.JProc Natl Acad Sci USA.2011 ,Oct 24.Epub ahead of print2Huang SH, Duan S, Sun T, Wang.et.al .JIP3 mediates TrkB axonal anterograde transport and enhances BDNF signaling by directly bridging TrkB with kinesin-1.JJ Neurosci. 2011 Jul 20;31(29):10602-14.3P Lang EM, Asan E, Plesnila N, Hofmann GO,Motoneuron survival after C7 nerve root avulsion and replantation in the adult rabbit: effects of local ciliary neurotrophic factor and brain-derived neurotrophic factor application.J Plast Reconstr Surg. 2005 ,115(7):2042-50.4Kim M W，Bang M S，Han T R，et al.Exercise increased BDNFand trkB in the contralateral hemisphere of the ischemic rat brain J.BrainRes,2005,1052（1）：16-21.5Singh KK, Park KJ, Hong EJ, Developmental axon pruning mediated by BDNF-p75NTR-dependent axon degeneration.JNatNeurosci.2008,11(6):649-58. 6Griesmaier E, Schlager G, Wegleiter K,Role of p75NTR in NMDAR-mediated excitotoxic brain injury in neonatal mice. Brain Res.J2010 ,1355:31-40. 7张三明,鲁翔,BDNF在局部脑缺血大鼠的表达J.江苏医药2008 ,34(10 )1032-10338李爱丽,孟晓萍,杨文.大鼠局部脑缺血再灌注下丘脑 CRH和 BDNF的表达J.中国老年学杂志.( Chin J Geront),2005(9):1073-10759Bjot Y, Prigent-Tessier A, Cachia C, Giroud M, Mossiat C, Bertrand N, Garnier P, Marie C.,Source，Time-dependent contribution of non neuronal cells to BDNF production after ischemic stroke in rats. JNeurochem Int,2011 ,58(1):102-11.10 FerrerI, KrupinskiJ, Goutan E,Mart E, AmbrosioS, Arenas EBrain-derived neurotrophic factor reduces cortical cell death by ischemia after middle cerebral artery occlusion in the ratJ.Acta Neuropathol, 2001 ,101(3):229-38. 11李英平，郭瑞芳，李育臣，李红艳，局灶性脑缺血大鼠海马区不同部位BDNF 的表达及其意义J.中国老年学杂志(Chin J Geront)2004,12(24 )；1180-118212Ploughman M, Windle V, MacLellan CL, White N, Dor JJ, Corbett D ，Brain-derived neurotrophic factorcontributes to recovery of skilled reaching after focal ischemia in rats.J Stroke. 2009 ,40(4):1490-5. 13 Maclellan CL, Keough MB, Granter-Button S, Chernenko GA, Butt S, Corbett D,A CriticalThresholdofRehabilitation Involving Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for Poststroke Recovery. JNeurorehabi and repair. 2011, Epub ahead of print14 Takeshima Y, Nakamura M, Miyake H, Tamaki R, Inui T, Horiuchi K, Wajima D,NakaseH ,Neuroprotection with Intraventricular Brain-Derived Neurotrophic Factor in Rat VenousOcclusion ModelJ. Neurosurgery. 2011 ,68(5):1334-41.15谭永星(TanYX),李雪梅(LiXM),文素芳(WenSF)，不同时间脑室注射 BDNF对大鼠脑缺血再灌注损伤氧化应激及神经细胞凋亡的影响J第四军医大学学报 (J Fourth Mil Med Univ) 2009, 30 (18) 1681-1684 16Visnen J, Saarelainen T, Koponen E, Castrn E.Altered trkB neurotrophin receptor activation does not influence the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist-mediated neurotoxicity in mouse posterior cingulate cortex.J Neurosci Lett. 2003 ,350(1):1-4.17朱贤富 ,王振华.脑缺血 /再灌注损伤机制的研究现状.J医学综述 (Med Reca) 2010,16( 18):2786-278918Cheng B,Mattson MP.NT-3 and BDNF protect CNS neurons against metabolic/excitotoxic insultsJ. Brain Res.1994 ,640(1-2):56-6719.Beck T, Lindholm D, Castren E , et al. BDNF protects against ischemic cell damage in hippocampusJ.CerebBlood Flow Metab,1994,14: 689-692.20Mller HD,Neder A,Sommer C,Schbitz WR,Different postischemic protein expression of the GABA(A) receptor alpha2 subunit and the plasticity-associated protein MAP1B after treatment with BDNF versus G-CSF in the rat brainJ. Restor Neurol Neurosci.2009;27(1):27-39.21徐晓晓(XuXX),周江堡(ZhouJB).BDNF对新生鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用的研究J.重庆医科大学学报(J CQ Med Univ)2010, 35(11):1642-1644 22Schbitz WR, Sommer C, Zoder W, Kiessling M, Schwaninger M, Schwab S. Intravenous brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size and counterregulates Bax and Bcl-2 expression after temporary focal cerebral ischemiaJ.Stroke.2000,31(9):2212-7. 23Zhu JM,Zhao YY,Chen SD,Zhang WH,Lou L,Jin X.Functional recovery after transplantation of neural stem cells modified bybrain-derived neurotrophic factorin rats withcerebral ischaemia.J J Int Med Res.2011;39(2):488-98.24Frankel AD , Pabo Co. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virusJ. Cell ,1988(1) ,55:11891193.25 S Asoh, I Ohsawa, T Mori, et al. Protection against ischemic brain injury by protein therapeut