中药指纹图谱的测定（04年省药分学术会）.ppt

中药指纹图谱的测定晁若冰（四川大学华西药学院）,一、测定中药指纹图谱的意义中药指纹图谱的定义:中药指纹图谱（Fingerprint）是经光谱、色谱或其他方法测定得到的中药组分群的特征图谱，带有综合、宏观、“模糊”的非线性特征，具有完整性和唯一性，是评价中药质量的重要手段之一。,测定中药指纹图谱的意义：1.对保证用药的安全、有效，保证药品质量的稳定具有意义。2.有利于中药作用机理的进一步深入研究。3.可以促进中药工业现代化，中药农业现代化。4.可以促进中药走向世界。,二.检测方法（一）色谱法1.薄层色谱法（TLC）薄层色谱法分离效能高，操作简便，图像直观、形象，有多种显色剂供选择使用，可以作多样品的平行分析，使用薄层扫描法可以得到定量的薄层指纹图谱。需使用标准的材料和条件，才能得到高质量的、可重复的结果。薄层色谱法多用于无紫外吸收，不能用HPLC测定的样品，也可以作为HPLC的补充和佐证。,二.检测方法2.高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法分离效能高，重复性好，准确性高，适用范围广，是指纹图谱测定应用最多的方法。使用的检测器有：紫外检测器，蒸发光散射检测器，示差折光检测器，质谱（LC-MS）等。多用反相色谱，也可以使用吸附色谱。如组分保留时间的差别很大，可以使用梯度洗脱。,二.检测方法,3.气相色谱法(GC)气相色谱法分离效能高，重复性好，准确性高，有通用型的检测器。主要用于挥发性样品的测定。,二.检测方法,4.毛细管电泳(HPCE)毛细管电泳分离效能高，灵敏度高，对样品预处理的要求不太高。主要用于带电荷组分的分离，特别是大分子物质的分离，如蛋白质、多肽、核酸等。也可以用于小分子的或一般有机组分的分离。,二.检测方法,（二）光谱法1.紫外分光光度法是分子的电子光谱，反映生色团的特征吸收，不能反映组分整体的情况。紫外光谱的形状简单，易重叠，鉴别意义不大。,二.检测方法,2.红外光谱法（IR）是分子的振动转动光谱，结构的信息量较紫外光谱大，但对多成分的混合物，难以确定归属。,二.检测方法,3.核磁共振光谱(NMR)核磁共振光谱的专属性强，信息量大，可以定量，是一种有前途的指纹图谱的测定方法。,三.色谱指纹图谱研究的技术要求,（一）供试品的收集以承认传统的功能主治和长期临床验证结果为前提，使用的标准样品应为经长期临床使用证明是安全、有效的样品。要收集有代表性的供试品，至少10批。,（一）供试品的收集,1.原料药材应有稳定和固定的来源，要进行基原鉴定，并经检验符合中国药典或国家药品质量标准。药材的“批”是指相互独立的供试品。应有完整的采样原始记录。,（一）供试品的收集,2.半成品（提取物）用符合要求的药材为原材料，用规范的工艺生产的半成品。应有完整的制备和相关信息的记录。,（一）供试品的收集,3.成品用符合要求的半成品和规范的工艺生产的产品。应有完整的制备和相关信息的记录。,（二）参照物参照物：是指纹图谱测定用的参照物质。主要用于色谱峰的辨认，考察指纹图谱的稳定程度和重现性。参照物一般选择容易获得的主要活性成分或指标成分，一个或一个以上。如无参照物也可以用指纹图谱中稳定的色谱峰作为参照峰。参照物应有明确的化学结构、名称以及质量考察的指标。,（三）测定方法,1.HPLC色谱条件的选择：首选反相HPLC。色谱柱：比较不同类型、不同牌号的色谱柱，选出适合的色谱柱，确定色谱柱的来源与规格。应考虑使用多数实验普遍使用的色谱柱。流动相：至少用三种不同组成的流动相进行比较，选出最适合的流动相。如需要使用梯度洗脱，应尽量采用线性梯度，并报告滞后时间。,（三）测定方法,测定波长的选择：既要满足主要有效成分的检测，也要考虑尽可能多地检出药物中的组分。通过比较不同波长的检测结果，选出合适的检测波长。,（三）测定方法,2.TLC薄层板：多使用硅胶薄层板，聚酰胺膜薄层板或纤维素薄层板。正式测定时，应使用有质量保证的商品预制板或高效预制板。展开剂：至少比较三种不同的展开系统，选出最适合的展开系统。注意温度和相对湿度对色谱行为的影响。,（三）测定方法,显色：可以结合使用通用型显色剂和专属显色剂，以获得整体的和不同类别组分的图谱。图象摄影：普通相机或数码相机（200万象素以上），可以用积分软件生成轮廓扫描图和积分数据，也可用薄层扫描仪进行积分和绘制轮廓图谱。,（三）测定方法,3.GC色谱柱：最好使用毛细柱，填充柱如能满足要求也可以使用。通过比较不同极性的色谱柱，以确定最适合的色谱柱。柱温：可使用恒温或程序升温，程序升温宜采用线性程序，尽量避免复杂的多阶程序其他测定条件：如进样器温度、检测器温度、气体流速等也应确定。检测器：尽量使用FID。,（四）色谱指纹图谱标准的建立,指纹图谱标准的建立包括标准指纹图谱（对照模式）的建立和样品指纹图谱的测定及相似性的判断。,（四）色谱指纹图谱标准的建立,1.色谱峰的辨认以相对保留时间为依据对色谱峰进行辨认，从原料药材出发，找出具有指纹意义的峰进行编号，缺峰缺号。,（四）色谱指纹图谱标准的建立,2.相似性的评价的方法：相似性：指两张指纹图谱之间相似的程度。包括供试品指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似性，供试品指纹图谱之间的相似性,（四）色谱指纹图谱标准的建立,相似性包括两个方面：（1）色谱的整体面貌的相似性峰的数目、各峰峰面积的比例，即总体面貌是否相似。（2）总积分值的量化比较供试品与对照样品或对照用指纹图谱总积分面积的差异（量的差异）。,（四）色谱指纹图谱标准的建立,3.相似性的判断方法（1）通过共有峰判断（2）通过相似度判断,（1）通过共有峰判断共有峰：不同样品的指纹图谱中所共有的指纹峰称为共有峰。重叠率：重叠率=2共有峰数/供试品与对照样品色谱峰总数重叠率不得低于一定的限度。供试品中共有峰与参照峰面积的比值与标准指纹图谱比较，不得超过一定的限度。供试品中非共有峰的面积占总峰面积的比值，不得超过一定的限度。,（2）通过相似度判断,对照模式的计算：选10批标准样品，测定指纹图谱，计算对照模式。有两种算法：平均矢量平均矢量式中X1,X2,Xn为矢量，代表第1，2到第n个样品的指纹图谱。X1=（x1,1,x1,2,x1m）,中位数矢量中位数矢量median(X1j,X2j.Xnj)中位数矢量是把对应的矢量按大小排列，取处于当中的矢量作为对照模式。如果样品数为奇数时，中位数只有1个；样品数为偶数时，中位数是当中两个数的平均值。推荐使用平均矢量。,相似度的计算：把供试品和对照模式的指纹图谱作为两个矢量，矢量(x1,x2,xn)代表样品X的图谱，其中xi代表样品X图谱中第i个色谱峰的峰面积；矢量(y1,y2,yn)代表对照模式Y的图谱，yi代表对照模式图谱中第i个色谱峰的峰面积。可以用下面两种方法表示相似度。,相关系数相关系数相关系数越接近于1，两个样品越相似。,夹角余弦夹角余弦夹角余弦是矢量(x1,x2,xn)和(y1,y2,yn)在矢量空间夹角的余弦。两张图谱可用多维空间中的两个点来代表，两个样品越相似，则其夹角越小，夹角的余弦值越接近于1；当两个样品等同时，夹角为0，夹角余弦等于1。,若2个样品中分别只有2个色谱峰，则每个样品可以用二维的向量来表示。2个样品可以表示为直角坐标系中的两个点，其夹角为。,=根据差角余弦定理，cos=cos()=coscos+sinsin=一般相关系数或夹角余玄在0.91.0之间，相似度符合要求。,（六）方法的考察1色谱系统适用性试验一般按参照物计算。包括：柱效，主要色谱峰的分离度。2精密度包括日内精密度，日间精密度，重复性。计算保留时间、相对保留时间和峰面积的RSD值，也可以计算一组测定结果的相似度。3耐用性使用三根不同的色谱柱进行比较。,（七）应用示例1.丹参注射液指纹图谱的测定色谱条件：Luna5uC18(2)柱，流动相A：水-冰醋酸（1000.8）；流动相B:乙腈-冰醋酸（1000.8），用梯度洗脱。280nm检测。,（七）应用示例2.沙棘指纹图谱的测定色谱条件：Shim-packVP-ODS柱，流动相A：乙腈；流动相B：0.4%磷酸水溶液，用梯度洗脱，360nm检测。,3.中药枳壳的化学模式识别枳壳供试液制备精密称取不同来源的药材粉末(过4号筛)各20g，精密加入甲醇50ml，称定重量，冷浸1h，加热超声20min，静置冷却，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，置旋转蒸发仪回收溶剂，残渣用甲醇溶解，定容至5ml，即得。,精密吸取上述枳壳供试液各4l，分别用自动点样仪成条带状点样于硅胶G60预制板上，在相对湿度65的调节缸中放置1h，取出，放入双槽展开缸中，以氯仿甲醇乙酸(75：25：5)为展开剂，展开，展距约15cm。取出薄层板，晾干，以2三氯化铝乙醇溶液为显色剂，110加热5min，使斑点清晰。,将显色后的薄层板置于薄层色谱扫描仪中扫描，光束狭缝：6.000.45mm；扫描速度：20mm/s；分辨率：50m/step；扫描波长：300nm；扫描灯：D2；扫描模式：荧光；滤镜：K400。经过对11批枳壳样品薄层扫描图的分析比较和判断，确定了能体现枳壳药材共性、可对其进行有效鉴别的11个特征峰，这11个特征峰的Rf值分别为0.05、0.11、0.17、0.21、0.28、0.36、0.41、088、0.91、0.94、0.97。,4.双黄连胶囊的X-射线衍射指纹图谱实验仪器：日本理学RigakuD/max2400粉末x射线衍射仪。实验条件为：CuKal辐射，石墨单色器，管压40kV，管流150mA，2扫描范围360，扫描速度8/min，步长0.02。,参考文献1.中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技