琼脂糖凝胶电泳目的及后续工作

琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。1. 分离纯化大片段DNA 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。分离后如需回收：将需要的DNA胶部分切下，尽量不要切到多余的胶。切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚或氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。2. 提取大分子DNA 构建大片段基因组文库的关键就是获得高分子量的基因组DNA。而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA;酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA，但极易造成基因组断裂，也难以得到大于300kb的基因组DNA。两种方法均不能达到目的，但经过研究人员不懈的研究，利用琼脂糖凝胶制备成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。在此过程中研究人员在用低熔点琼脂糖还是普通熔点琼脂糖制备凝胶块的问题中选择了后者，因为低熔点琼脂糖价格昂贵且胶块在制备纯化的过程中容易断裂，而普通熔点琼脂糖与低熔点琼脂糖在基因组DNA制备方面没有区别。3. PCR产物检测 在基因组DNA的提取中，DNA经孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗涤2次，再适量的双蒸水溶解DNA。然后在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以1kb DNA ladder 为参照，估计DNA溶液浓度。具体检验方法是:2.0%琼脂糖制成凝胶，取6 微升 AFLP-PCR产物与1微升上样缓冲液混匀后上样，用1TBE电泳缓冲液，120V电泳50min，使用EB溶液染色后在凝胶成像系统(ChampGel-3200)上观察拍照。4. 免疫扩散法中的应用 免疫扩散法是指抗原与抗体在同一凝胶中扩散的方法，是观察可溶性抗原与相应抗体反应和抗原抗体鉴定的最基本方法之一。利用琼脂糖凝胶作为扩散介质，使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。 利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质(分子量自十几万到几百万以上)自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。 双向琼脂扩散实验中也用琼脂或琼脂糖作为扩散介质，原因同上。5. 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 在生物技术实验中，PCR反应获得的目的片段，酶切后所得特定的DNA序列， 分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它DNA分开， 这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的DNA， 以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。柱回收试剂盒：目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，加入纯化填料填料吸附混合，快速离心沉淀去上清，洗涤沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清，就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收，但是操作就较前者复杂一些。低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。 透析带电洗脱法。切下的条带放在充满TAE的透析带中再电泳一段时间，让DNA走出凝胶，走向溶液中，再反向电泳一会儿，将附在透析带上的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀，那块胶通常还要再染色看看残留。由于绑透析带非常难搞，只有在万不得已的非常大的片断时才会考虑的。也是丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。DEAE纤维素膜纸片法和其他改良法。早期实验室最常用方法之一。将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难.6. Northern blot和Southern blot的第一步Northern blot （诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过Northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。而Southern blot 是一种常用的 DNA 定量的方法。这两种方法首先都要将DNA用凝胶电泳分离找出目的片段，再将目的片段转到固体膜上进行检测。Southern blot原理是将待测的 DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探