生物实验4 实时定量PCR 实验报告

实验四 定量PCR扩增姓名：李宗翰 专业：环境工程 学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料real time PCR仪 (ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品四、实验步骤 1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107， 106, 105, 104，向每管加入 90l ddH2O，取10l 108 copy/ul 的标样加入到 107 管中，充分混匀后，从管中取10l 107 copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip头。2、配制预混液：取119l ddH2O、7l引物4204f、7l引物4448r和7l Rox到装有175l SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、 106、 105、104、UNK（未知样）、NTC（阴性对照）。向其中分别加入42l预混液和4.7l模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品20l至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。将加好样的8联管振荡。5、设置分析仪参数如下：95 3min；95 15s+60 40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围6095。振荡好的样品进机进行PCR扩增。6、扩增后利用软件分析CT值及未知样的定量结果。五、实验结果与讨论1、实验结果如何？试分析。答：实验结果及分析如下。（1）、实验具体数据见下表WellTaskCC MeanC SDQuantityQuantity MeanQuantity SDCt ThresholdA1STANDARD8.2488 8.2527 0.0055 1000000000.0712 A2STANDARD8.2565 8.2527 0.0055 1000000000.0712 B1STANDARD11.3893 11.6598 0.3825 100000000.0712 B2STANDARD11.9303 11.6598 0.3825 100000000.0712 C1STANDARD15.3292 14.9668 0.5126 10000000.0712 C2STANDARD14.6043 14.9668 0.5126 10000000.0712 D1STANDARD19.4912 19.3080 0.2590 1000000.0712 D2STANDARD19.1249 19.3080 0.2590 1000000.0712 E1STANDARD22.5385 22.4196 0.1681 100000.0712 E2STANDARD22.3007 22.4196 0.1681 100000.0712 F1UNKNOWN8.9370 8.9691 0.0454 59501332583025841695285.6250.0712 F2UNKNOWN9.0012 8.9691 0.0454 57103836583025841695285.6250.0712 G1NTC32.5329 0.0712 G2NTC32.9549 0.0712 其中，A-E为标准样品，F为位置样品，G为阴性对照。每个样品做两个平行。通过软件分析，由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83107。（2）、扩增曲线从扩增曲线中可以看出，样品均经历了良好的扩增过程。（3）、标准曲线从标准曲线中可以看出，R2值较好，标准曲线可以使用。但扩增效率一般。其中106和107的两个平行样的CT偏差较大，这一现象可以从（1）表中看出，其SD分别为0.5126和0.3825，相比其他点较大，一般认为SD大于0.5不理想。（4）、融解曲线图中，可以看出每条曲线均为单峰且在一个合理的温度范围内（8286），所以扩增是正常的，不存在非特异性扩增。2、 实验过程中需要注意些什么细节？答：（1）、操作过程中尽量不要说话，以避免污染；（2）、用微量移液器加样品时应保证枪头深入液面以下，这样样品不会留在管壁上；（3）、不能在定量PCR管做标记，裸手不可以接触定量PCR管，操作时应戴手套。（4）、8联定量PCR管加完样后，可先将盖子放上，等放到振荡机上再把盖子盖紧。3、通过这个实验你有什么收获？这个实验对你今后开展相关实验研究是否有帮助？答：通过实验我加深了对定量PCR的理论认识，熟悉了实时荧光定量PCR的操作流程。这一实验对我今后研究环境问题的微生物活动方面是有帮助的。六、思考题如果你自己的试验过程中，发现扩增效率是0.76、1.52或0.99, 实验结果能用吗？如果结果不能用，请说明原因，怎么样改变实验来解决这个问题？答：扩增效率的有效值分两个范围，宽范围在0.8-1.2之间，窄范围在0.9-1.1之间。如题，若实验得到的扩增效率为0.76或1.52，均在宽范围之外吗，则说明扩增不太理想，数据不能直接用。可以通过删除某些偏差较大的点来提高扩增效率，若还不行，