生物化学实验

1,生物化学实验生化教研室张丽娜,2,学习生化实验的目的1.加深对生物化学理论知识的理解2.学习、掌握常用生物化学与分子生物学实验技术，如分光光度法、层析、电泳、离心等,3,实验报告的书写格式一、实验标题和日期二、实验目的三、实验原理四、实验操作步骤五、结果（真实和客观）六、结果分析（详细）七、意见和建议,4,实验须知,1、穿实验服，不迟到早退，课前预习。2、严格按照操作步骤进行每一步实验（时间性，反应剧烈），保持安静。3、药品用完归还原处，保持整洁。4、注意水、电、煤气和有腐蚀性、毒性的试剂的安全使用，自我保护。5、实验结束做好清洁卫生工作。6、如实客观地完成实验报告。,5,实验一酶的性质,一、实验目的：1.加深理解酶作用的特异性及高效率的概念2.掌握T、pH、a、i等是如何影响酶活性,6,二、实验原理,1、酶的专一性酶具有高度专一性，即对底物有严格的选择性。（产物的增多）淀粉麦芽糖蔗糖,唾液淀粉酶,+Cu2+(班氏试剂),Cu2O,砖红色沉淀,煮沸的唾液淀粉酶,7,操作步骤：1.制备稀唾液。用清水漱口，行咀嚼动作5分钟，制得唾液。2.立即分出约1ml，沸水浴煮沸约10min。,8,3、取小试管3只试剂（滴）1230.5%淀粉16160.5%蔗糖16稀唾液88已经煮沸的稀唾液8,混匀，置于37度水浴箱中保温10min,9,4.另取试管3支，各加班氏试剂20滴。并分别从表中三支试管中各取出溶液10滴，分别加入各试管中。,5.沸水浴中加热3min，冷却后比较现象。,注意事项：水煮沸后才可以开始加热试管。,10,2、温度对酶活性的影响,人体内大多数酶的最适温度为37至40。,本实验利用碘与淀粉及其水解产物的颜色反应，来比较唾液淀粉酶在不同温度下催化淀粉水解的速度。（底物的减少）（与碘呈蓝色）（与碘呈紫色至红色）（与碘不呈色）,淀粉,糊精,麦芽糖,唾液淀粉酶,唾液淀粉酶,12,3、取小试管3支试剂（滴）1230.5%淀粉101010PH6.8缓冲液3330.85%NaCl333,混匀，分别将1、2、3号试管依次置于沸水浴、温水浴和冰水浴中5min。然后向各管加入稀唾液3滴，继续放置5min。,13,4.每管取出2滴试液在白瓷板上，加碘液1滴，观察颜色,5.将1、3两试管改置37度水浴中5min，加碘液1滴，观察颜色变化并分析。,14,2、pH、激动剂、抑制剂对酶活性的影响,人体内多数酶的最适pH在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适pH为6.8。,15,氯离子对该酶活性有激动作用；铜离子则有抑制作用。本实验借助淀粉与碘的呈色反应来观察唾液淀粉酶的水解作用，从而判断pH、激动剂和抑制剂对酶活性的影响。（底物的减少）,16,实验二丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制,一、实验目的：掌握竞争性抑制作用的概念及其特点,17,二、原理：抑制剂与底物竞争酶的活性中心，而使酶活性受到抑制。这种竞争性抑制作用的强弱受抑制剂与底物相对浓度的影响。,18,琥珀酸延胡索酸,抑制,19,本实验用甲烯蓝作受氢体，接受琥珀酸脱下的氢，自身变为甲烯白。MB+2HMB：2H甲烯蓝（蓝色）甲烯白（白色）注意：甲烯白容易被空气氧化，所以需要隔绝空气。,20,三.实验操作,四.注意事项：肌肉提取液混匀加液体石蜡前将试管混匀，加后勿混匀。,21,实验三激素对血糖浓度的调节一、实验目的1.掌握邻甲苯胺硼酸法（O-TB）测定血糖浓度的方法及胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的调节作用2.了解比色分析的基本原理（Lambert-beer定律）3.掌握722型分光光度计的使用方法及比色分析计算公式,22,二、实验原理,（一）比色分析原理,有色溶液,T=I/I0A=-lgT=lgI0/I根据Lambert-Beer定律：A=KCL(K:吸光系数；C：溶液的浓度；L：光透过液层的厚度)A1=K1C1L1A2=K2C2L2K1=K2；L1=L2A1/A2=C1/C2,透光度,吸光度,溶质溶剂,23,（二）血糖测定(0-TB)原理酸性/邻甲苯胺1、己醛糖5羟甲基2甲醛呋喃席弗氏碱液H20H20(青色)2、G属于己醛糖，另取已知浓度的标准葡萄糖溶液，在同样条件下进行显色，得到青色的席弗氏碱液3、将未知液与标准液于722型分光光度计，分别测定600nm吸光度（A）4、将（A测）和（A标）待入计算公式，求未知液的血糖浓度,（未知）,24,三、操作方法1、动物处理（注射激素和采血）小鼠1腹腔注射胰岛素0.1ml小鼠2腹腔注射肾上腺素0.03ml小鼠3(正常对照鼠),分别剪头，收集血液于抗凝管中（边收集血液，边摇动试管，防止血液凝固）,作用半小时,25,腹腔注射针头与皮肤45夹角打入激素取量需要准确：胰岛素0.1ml肾上腺素0.03ml注射前赶走气泡,26,注意点（1）各种激素，取量需准确；（2）剪头取血，两个同学配合，边收集、边摇动，防止凝固；,27,2、提取血糖0.15%NaF精确加入上述收集的抗凝血小试管1支1.5ml0.1ml15CCl3COOH充分混匀混匀，室温放置5min0.4ml离心：3000rpm、5min上清液倒入另一小试管按P9表操作，测定血糖浓度:,28,3、血糖浓度的测定试液（ml）正常胰肾标准上清液1.01.01.0标准G液1.0O-TB试液3.03.03.03.0混匀，于100水浴7min，冷却，600nm下比色测定各管A值(600nm),29,Au100AuAs0.05As,0.05,=,=全血中葡萄糖含量（mg/dl）,100,4、计算,30,5、注意点（1）各种激素，取量需准确；注射前，需赶走气泡；（2）剪头取血，两个同学配合，边收集、边摇动，防止凝固；（3）精确吸取血液0.1ml；（4）离心：平衡、对称、定时定速；（5）O-TB试剂，腐蚀性强，防止溢出；（6）比色杯按序使用；（7）做好清洁卫生工作。,附：（1）抓鼠法；（2）注射法；（3）加样器的使用；（4）离心机的使用；（5）比色计的使用,31,操作步骤：1.接通电源2.调节所需波长3.灵敏度开关处于“2”4.调节仪器“零点”：空白管对准光路打开比色槽盖，调节：T0关闭比色槽盖，T=1005.依次拉动比色槽架，读取相应各管的“A”值6.记录各样品管的A值7.测定完毕，倒掉比色杯内液,32,样品管要求：台秤平衡对称插入定时、定速,33,加样器的使用1、先调好刻度2、打至第一档吸入试剂3、打出试剂时要按至第二档4、使用加样器时要慢、稳,34,离心机的使用台秤平衡对称插入定时定速,35,实验三血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-Ch）的测定及尿醋酮试验,一实验目的：1.掌握血清中HDL-Ch的测定方法2.掌握尿醋酮的实验方法3.进一步练习分光光度计的使用,36,二、实验原理1、,LDL,VLDL,中的apoB,Mg2+,磷钨酸,不溶性复合物,HDL（富含ch）,Ch+显色剂（主要Fecl3）显色测定,37,三、实验操作与结果分析（详见讲义）取小离心管0.2ml血清+0.2ml沉淀剂充分混匀3500rpm，8min,得上清取小离心管0.2ml上清+1ml抽提剂充分混匀3500rpm,5min,得上清取3支大试管，按表格准确加入试剂。充分混匀，静置15min，550nm波长比色,38,四、注意事项1、浓硫酸使用的安全（加样、混匀、倾倒）2、各步均需要混匀充分，否则会影响测定的数值3、移液管的使用1）左手吸耳球，右手拿移液管，食指按住管口2）读刻度时眼睛和刻度线处于同一水平线，以下凹面为准3）再次使用移液管应该润洗,39,2、丙酮+亚硝酰铁氰化钠紫红色化合物（光环）,NH4OH,40,实验四动物组织总RNA的提取,实验目的1.掌握从组织中分离提取RNA的方法2.掌握RNA纯度和完整性的评价方法3.掌握RNA提取的无RNA酶操作,41,实验原理,1.一步法总RNA提取试剂Trizol提取总RNA2.RNA样品质量的评价：完整性和纯度纯度：OD260/OD280为1.72.0（低于此值多为蛋白质污染）完整性：琼脂糖凝胶电泳中光密度28S/18S大于等于2：1且大多可见明显的5S区带,42,真核生物的rRNA包括小亚基18S和大亚基28S、5S、5.8S,43,实验步骤,1、取大鼠肝脏组织匀浆（准备室老师准备）冰浴放置15min2、10000rpm，10min3、取上清（约0.8ml）0.2ml氯仿剧烈摇匀放置3min10000rpm,15min4、取上层水相（无色，约0.4ml）异丙醇0.5ml轻微混匀，放置10min13000rpm,10min,44,5、弃上清，得沉淀75%乙醇1ml吹打（用枪，飘起来即可）10000rpm,5min6、弃上清（用枪吸干多余液体）DEPC水100ul弹指混匀7、取上述溶液10ul，DEPC水稀释至3ml（5ml试管中）260nm,280nm分别比色,45,计算OD260/OD280:1.72.0之内结果较好,46,注意事项RNA提取的关键是防止RNA被降解，主要是RNA酶的降解作用1、实验过程中带手套与口罩2、玻璃和塑料器皿的高压消毒：玻璃器皿：220，3h塑料器皿：用新配制的未高压处理的DEPC（二乙基焦碳酸酯）水浸泡过夜，临用前用高压处理过的DEPC水冲洗。,47,实验五血清谷丙转氨酶的测定,一实验目的：1.掌握比色法测定GPT活性的方法2.学会使用标准曲线3.进一步学习使用分光光度计,二、实验原理,49,操作步骤,取大试管两支，标号，按表格操作12基质液0.5ml肝匀浆0.1ml0.1ml混匀，置于37水浴保温30min2，4-二硝基苯肼0.5ml0.5ml基质液0.5ml混匀，置于37保温20min0.4MNaOH5ml5ml混匀，静置10min后，520nm比色，蒸馏水调零，测A,50,结果的获得用A测定A空白=所得值查标准丙酮酸吸光度曲线直接读出吸光度值。本法所规定的血清谷丙转氨酶活性单位的定义是：1ml血清于37与底物作用30分钟，产生2.5ug丙酮酸为1个谷丙转氨酶单位,51,注意事项,1、注意试剂的顺序不要加错2、保温时间要准确3、对照标准曲线直接查出酶的活性,52,实验六血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,一、实验目的1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作2.了解如何测定血清各种蛋白质的相对百分含量,53,二、实验原理,1.电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。,54,血清蛋白白蛋白12-球蛋白PI4.645.065.065.126.85-7.5MW（万）6.95-20309-1530电泳时常采用pH8.6的缓冲液,故血清蛋白均带负电，朝阳极移动。由于分子大小和带电荷数不同，泳动速度不同。电荷越多，分子越小，泳动越快。,55,三实验步骤,1、点样：a用滤纸吸去薄膜上多余液体b点样均匀。2、待薄膜完全浸透后，点样面向下，点样端朝外，两端紧贴在滤纸桥上，通电。3、电泳：110V，60min。4、染色：关闭电源，氨基黑染液中2min，漂洗至背景无色