从个性化医疗看分子诊断的发展.ppt

,从个性化医疗看分子诊断的发展,药物不良反应的严重性和普遍性,3,3,传统的用药模式,经验性处方药物,现在和将来,药A,药C,药B,明确诊断,传统,药A,药B,药C,药D,个性化处方药物,尝试、更换,确定、治疗,千人一个标准：依据不同医师的经验而有治疗差异，花费较多时间、金钱、治疗效果不能确定,每人一个标准：依据分子检测结果采用针对性治疗，节约大量时间、金钱，达到最好治疗效果,基因导向的个体化用药,个性化医疗需要分子诊断指导,个性化医疗需要分子诊断指导,在2009-2010年两年中，我们利用医学参考报检验医学频道作为交流的平台，报道了分子诊断在个体化用药中的指导作用,8,如何实现个体化用药？,分子分型药物疗效,分子诊断对临床用药的指导意义,代谢酶,转运蛋白,药物靶点,CYP450等,MDR,Heu-2、EGFR等,遗传变异SNP,单核苷酸多态(singlenucleotidepolymophismSNP)：由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是决定个体差异的最主要的遗传基础。,药物代谢基因SNP,快代谢型（EM）,中间代谢型（IM）,慢代谢型（PM）,突变型杂合子,不同基因型个体对药物的反应,13,新的医学模式：个体化用药（PersonalizedTherapy），根据基因检测结果提出治疗方案,诊断,基因检测-预测反应,治疗,理想反应,打破传统用药的弊端,新的医学模式个体化用药,卫生部关于印发医疗机构临床检验项目目录的通知,卫医发2007180号,分子诊断对临床用药的指导意义,CYP450,EGFR,基因多态性,酶活性改变,药物代谢速度改变,有效突变,无效突变,酪氨酸激酶抑制剂治疗有效,酪氨酸激酶抑制剂治疗无效,16,个性化用药的多态性（SNP）检测,细胞色素P450基因多态性检测对临床个性化用药的指导作用,CYP450基因多态性与抗凝药物的个性化用药,CYP450基因多态性对抗病毒药物用药的指导作用,CYP450基因多态性对抗真菌用药的指导作用,CYP450基因多态性与抗凝药物的个性化用药,氯吡格雷,抵抗的发生率,430%,CYP2C19681GA,抗血小板药物,CYP2C19的活性与药效密切相关!携带CYP2C19突变基因患者，氯吡格雷疗效大大降低!,美国FDA建议患者服用氯吡格雷前需检测CYP2C19基因型,CYP450基因多态性对抗病毒药物用药的指导作用,依法韦伦,非核苷逆转录酶抑制剂，是高效抗逆转录病毒药物,代谢速度与CYP2B6基因多态性有关,CYP2B6基因516位点,TT,GT,GG,代谢速度慢,代谢速度快,代谢速度中,产生毒性,药物无效,CYP450基因多态性对抗真菌用药的指导作用,伏立康唑,CYP2C19,清除,突变型,野生型,亚洲人中占60-70%,突变型血药浓度是野生型的2至4倍,10%人群UGT1A1基因突变导致UGT1A1活性降低，增加了粒细胞减少的发生率,剂量如何精确调整还不清楚,BasedondatafromInnocentietal(2004),25,靶向治疗的个体化用药检测盒（突变）,EGFR分子靶向治疗我们得到的启示,分子靶向治疗成功的例子,伊马替尼,费城染色体（BCR-ABL）阳性的慢性骨髓性白血病,酪氨酸激酶抑制剂,非小细胞肺癌,酪氨酸激酶抑制剂,小分子化合物,单克隆抗体,如吉非替尼和埃罗替尼,如西妥昔单抗,吉非替尼治疗非小细胞肺癌历程,首次临床试验,对药物的反应率：9%-18%,总体生存率：无明显提高,根据EGFR基因突变分组,基因突变组对吉非替尼的疗效显著高于非突变组,无进展生存率显著高于无基因突变患者,总体生存率无明显差异,EGFR抑制剂疗效需要生物标志来鉴别,总体生存率,吉非替尼对NSCLC靶向治疗得到的启示,分子靶向治疗需要根据靶点的特性进行选择，分子靶向治疗也需要个体化医疗，而个体化医疗需要大量的分子生物学检测来支持。目前，由于许多疾病发病机制尚不明确，personalizedmedicineisstillinitsinfancy，因此我们必须发展各种检测方法和检测项目来支持和推进个体化医疗。,基因表达与临床用药,RRM1过度表达可作为吉西他宾耐药预测因子,TUBB3高表达对紫杉和长春碱类不敏感,STMN1表达检测意义,-20,0,20,40,60,80,100,ShrinkageinTumorSize(%),Bepleretal.JCO2006;24:4731-7.,PhaseIItrialinpatientswithlocallyadvancedNSCLCtreatedwithcisplatin/gemcitabine(n=35),SD,PR/CR,Median2.85,RRM1Expression,Reddotsindicatepatientswithlessthan30%tumorshrinkageisstabledisease(SD),andgreendotsindicatepatientswithgreaterthan30%tumorshrinkage(partialremission/completeremission(PR/CR).,Time(months),Cumulativesurvival,P=0.039,7.5,RRM1过度表达可作为吉西他宾耐药预测因子,TUBB3高表达对紫杉和长春碱类不敏感,TUBB3阳性表达是抗微管类药物敏感预测因子,34,STMN1表达检测意义,预后：表达水平越高，患者的生存率越低，肿瘤发生转移的风险越高。,疗效：低表达接受长春瑞滨/顺铂治疗的效果较好，中位生存期较长；STMN1高表达接受长春瑞滨/顺铂的疗效较差。,ElizabethAetal.CancerRes.2002;62:6864-6869,QPCR-HRM技术,HRMA技术（high-resolutionmeltinganalysis）即高分辨熔解曲线分析技术，是近年兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。,一、QPCR-HRM技术介绍,HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。,HRM技术原理图,HRM技术特点,HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到5%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。qPCR-HRM的突变检测已获国际多中心双盲实验验证，灵敏度和准确性比国际公认的DxS（Qiagen收购）公司产品还要更好，见下述参考文献1。,重要参考依据:1.VickiWhitehall,KaylaTran,AartiUmapathy.AMulticenterBlindedStudytoEvaluateKRASMutationTestingMethodologiesintheClinicalSetting.JournalofMolecularDiagnostics,Vol.11,No.6,November2009.2.OliverGeulen,ChristianWeilke,MichaelHoffmann.TheLightCycler480real-timePCRsystem:aversatileplatformforgeneticvariationresearch.NatureMethods5,(29February2008)doi:10.1038/nmeth.f.207.3.EraliM,VoelkerdingKV,WittwerCT.2008.Highresolutionmeltingapplicationsforclinicallaboratorymedicine.ExpMolPathol85:5058.,HRM技术应用举例（SNP）,检测低水平突变的新方法COLD-PCR技术,在分析临床样本时常需检测野生型DNA中的未知低水平体细胞突变。然而，现有检测方法的选择性和敏感性常受到限制。利用测序法在突变率达到10%时能够检测到；而利用高分辨熔解曲线（HRM）也只能在突变率达到5%时被检测到。,为了迅速筛查和检测低水平未知突变，2008年哈佛大学放射肿瘤系的JinLi等人发明的一种新PCR方法COLD-PCR。,检测低水平突变的新方法COLD-PCR技术,检测低水平突变的新方法COLD-PCR技术,这种PCR的基本操作是：将提取的DNA进行10次左右的传统PCR，然后对产物进行稀释，在低变性温度下进行PCR。这样使突变和野生型各占一半，扩大了突变比率，使突变点能够被测到。,检测低水平突变的新方法COLD-PCR技术,研究结果表明与普通PCR/HRM相比COLD-PCR/HRM可以检测出野生型DNA中0.1%1%的突变，其选择性提高了6-20倍。而且HRM检测到的突变94%与COLD-PCR扩增子测序结果吻合。这些说明COLD-PCR/HRM是一种选择性高、限制性低、灵敏性高的筛查未知低水平突变的方法。,检测低水平突变的新方法COLD-PCR技术,如果COLD-PCR技术结合特异探针，其检测灵敏度是否还会提高？是否能够检测血浆中游离DNA的低比率突变？,个体化医疗发展我们应该做些什么？,个体化医疗是根据个体携带的遗传信息制定针对性的进行诊断、预防和治疗的策略，是对传统医学的挑战。而真正做到个体化医疗需要个体化诊断的支持，特别是实验室检测的支持。这也为检验医学提出了新的挑战。面临新挑战，检验医学应该做些什么?,由于个体对疾病和治疗的反应差异很大，需要用检测基因变异、蛋白质组和代谢过程中的生物学标志物来体现疾病的状态，从而达到预防、诊断和治疗的目的,增加实验室检测信息的提供,不但要不断增加和更新检测项目，而且要对项目信息进行整合，使其能够反应个体的生物学特性，如代谢过程、遗传变异等，并预测疾病的发生,加强对普通检测项目的分析,利用在个体不同时期变异较小的检测项目，通过对这些项目做统计学分析，能够帮助监测个体状态,增加特异性检测项目,个体化医疗发展我们应该做些什么？,个体化医疗发展我们应该做些什么？,增加实验室对个体差异的检测,基因多态性是个体差异的基础，因此加强实验室对个体差异的检测，从而指导临床对疾病的预防、诊断和治疗,用现代生物信息学武装检验医学,检验科一直是位于信息学的前