实验四--醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白概论PPT课件

.,1,实验四血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,目的1、掌握电泳的基本原理2、掌握电泳的基本操作,.,2,原理-电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象,各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。不用支持物的利用支持物1）纸电泳2)淀粉凝胶电泳3)琼脂糖凝胶电泳4）醋酸纤维薄膜电泳5）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,.,3,泳动度U,泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度U=v/E=dl/VtE:电场强度，每cm的电压降，V/lv:颗粒的移动速度，d/td:颗粒的移动距离t:通电时间V:加在支持物两端的实际电压l:支持物的有效长度,.,4,影响泳动速度的主要因素,1）电场强度：（越大，移动速度越快）常压电泳：100-500V，2-10V/cm高压电泳：500-10000V，20-200V/cm2）溶液的pH值：buffer。8.603）溶液的离子强度：（I越大，速度越慢；缓冲效果越好），0.02-0.2之间。0.074）电渗现象：液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。尽量避免有高电渗作用的支持物。,.,5,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,Davis和Ornstein1959年-人血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺（Acr，单体）和N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis，交联剂）共聚合而成（由过硫酸铵-四乙基乙二胺TEMED系统或核黄素-TEMED系统激发）。分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制孔径大小，达到不同的分离目的。凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）,.,6,.,7,.,8,SDS：十二烷基硫酸钠CH3（CH2）11OSO3Na，阴离子去污剂，与蛋白质结合，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，破坏蛋白质的二级、三级、四级结构。1）先加还原剂如巯基乙醇打开-S-S-；2）SDS破坏蛋白质构象，与氨基酸侧链充分结合，形成蛋白质亚基-SDS胶束。SDS是阴离子，使多肽链带上负电荷，该电荷量远远超过蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质之间的电荷差别。电泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。,SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,.,9,作用,使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质-SDS胶束，消除蛋白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，短轴均为1.8nm，长轴正比于蛋白质分子量。MW在15200kDa，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。logM=a-bRf，Rf为迁移率,.,10,.,11,醋酸纤维薄膜电泳(CAME),以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、1、2、球蛋白5条区带。,.,12,人血清中常见蛋白质的等电点和分子量,蛋白质等电点分子量正常参考值（%）清蛋白4.886900057-681-球蛋白5.062000001.0-5.72-球蛋白5.063000004.9-11.2-球蛋白5.1290000-1500007-13-球蛋白6.85-7.2156000-3000009.8-18.2负极正极,球蛋白/-球蛋白/2-球蛋白/1-球蛋白/清蛋白,.,13,器材,1醋酸纤维薄膜(8X2mm)2点样器3染色皿，漂洗器，镊子4电泳仪：电泳仪电源，水平电泳槽,.,14,试剂,1巴比妥缓冲液(pH8.6)：取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加蒸馏水加热溶解后稀释至1升。2氨基黑10B染色液：取氨基黑10B0.5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。3漂洗液：95乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml,.,15,操作-准备,l醋酸纤维薄膜(CAM)的准备：薄膜放进缓冲液中，自然浸润，约20分钟。2电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边缓冲液高度一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖.3点样：将充分浸透(指膜上无白色斑痕)的薄膜取出，用滤纸轻轻吸去膜上过多缓冲液，粗糙面(无光泽面)用于点样，载玻片蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。,.,16,操作-电泳,4加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端。薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电。5连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V。电泳50分钟，断电。6染色：用镊子取出薄膜条投入染液8分钟，染色期间轻轻晃动染色皿，使染色充分。7.漂洗:从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰