时间分辨荧光免疫分析PPT课件

.,1,5-2时间分辨荧光免疫分析,郑鹄志西南大学化学化工学院,.,2,发展历程,1979年，可标记抗体的Eu3+-二酮体-EDTA1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究”获2003年度国家科技进步二等奖,.,3,一、时间分辨荧光免疫分析特点,.,4,1.荧光衰减时间长,镧系元素荧光衰变时间,.,5,常见荧光物质荧光寿命,.,6,2.Stokes位移大,.,7,镧系元素发射峰窄,.,8,优点,灵敏度高（10-18mol/孔）原子标记多标记技术,.,9,二、时间分辨荧光免疫分析体系,非均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析,.,10,（一）非均相时间分辨荧光免疫分析,时间分辨固相免疫分析解离增强荧光免疫分析酶放大免疫分析,.,11,1.时间分辨固相免疫分析,灵敏度一般不高,.,12,实例加拿大CyberFluor的FIAgen系统Eu3+-BCPDA为标记物,.,13,2.解离增强分析,原理示意图,.,14,（1）双功能螯合剂,EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接近中性时，螯合物足够稳定酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放Eu-DTTA应用最广泛,.,15,（2）增强液,增强原理图一般增强百万倍,.,16,-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2复合物TOPO：荧光增强协同剂TritonX-100：表面活性剂，形成胶束醋酸：酸性介质,.,17,（3）酶放大,酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物ALP,.,18,酶放大免疫分析示意图,.,19,双标记测定AFP和-hCG,-NTA作为螯合剂340nm激发，Eu:615nm,820s；Sm:643nm,88s,.,20,（二）均相免疫分析,基于时间分辨荧光共振能量转移无需洗涤、分离、加增强液,.,21,TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射615nm，供体APC：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受体能量转移效率最高的供体/受体对,.,22,时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图,.,23,三、时间分辨免疫分析方法,夹心法竞争法间接法捕获法生物素-亲和素放大法,.,24,1.夹心法,双抗体夹心法,.,25,双抗原夹心法,.,26,2.竞争法,.,27,3.间接法,间接法测定HCV抗体,.,28,4.捕获法,捕获法测定抗-CMVIgM,.,29,5.生物素-亲和素法,生物素-亲和素检测PAPP-A,.,30,四、应用,1.肿瘤标志物检测2.传染病检测3.糖尿病检测4.激素检测5.细胞活性检测,.,31,1.肿瘤标志物,AFP测定：双抗体夹心法固相包被抗体加入样品或标准品加入Eu标记抗体加入增强液测定荧光灵敏度：0.17U/ml,.,32,2.传染病检测,梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育加入铕标记抗原，孵育加入增强液，检测荧光符合中国药品生物制品鉴定所结果,.,33,3.糖尿病检测,C-肽检测：双抗体夹心法抗体包被微孔板加入标准品或样品加入铕标记抗体增强液，检测荧光灵敏度：0.08ng/ml,.,34,4.激素检测,三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法微孔板中加入抗体标准品或样品、铕标记T3加入增强液，测定荧光灵敏度：0.21ng/ml,.,35,5.细胞活性检测,测定细胞活性原理图,T：靶细胞E：效应细胞,.,36,NK