吉林农大生化--——蛋白质PPT课件

.,1,（1）成肽反应：一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。,4、氨基酸的重要化学反应,.,2,（2）与茚三酮反应茚三酮在弱酸中与-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（max=570nm）。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。Pro、Hy-Pro与茚三酮反应直接形成黄色化合物（max=440nm）,.,3,.,4,（3）桑格（Sanger)反应：2.4一二硝基氟苯（DNFB）氨基酸DNFBDNP氨基酸黄色，层析法鉴定,用于测定多肽的N-末端氨基酸,OH,.,5,OH,(4)埃德曼反应(Admanreaction）异硫氰酸苯酯，PITC氨基酸PITCPTC氨基酸（苯氨基硫甲酰氨基酸）PTH-氨基酸（苯乙内酰硫脲氨基酸）无色，可以用层析法分离鉴定。用来鉴定多肽的N-末端氨基酸,强H,.,6,第三节蛋白质的分子结构MolecularStructureofProtein,.,7,一、蛋白质结构的层次,高级结构,三级结构,四级结构,化学结构,.,8,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,.,9,二、肽与肽键1、概念,.,10,肽（peptide）：一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。肽键（peptidebond）：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰胺键）。肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,氨基酸残基(residue)肽链中的每个氨基酸单位，被称为,.,11,*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽，有几个氨基酸残基就叫几肽。,*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,.,12,B.中文名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸C.三字母写法：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu或D.单字母写法：,2、肽的表示法:,A.结构式表示法,.,13,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,.,14,3、天然存在的活性肽（1）谷胱甘肽(glutathione,GSH)GluCysGly红细胞中的巯基缓冲剂。参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。,.,15,（2）短杆菌肽（抗生素）和缬氨霉素短杆菌肽是由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化脓性病症。L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-OrnL-LeuD-PheL-ProL-Val(3)脑啡肽（5肽）Met-脑啡肽：TyrGlyGlyPheMet具有镇痛作用。,.,16,三、蛋白质一级结构（一）蛋白质一级结构的定义及表示法一级结构（又称化学结构或共价结构）：是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，包括二硫键的位置和数目。,主要的化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,蛋白质的表示法与肽相同，多用缩写符号来表示肽链的结构和名称。,.,17,（二）蛋白质测序的一般步骤（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）断裂链内二硫键。（4）分析多肽链的N末端和C末端。（5）测定多肽链的氨基酸组成。（6）多肽链部分裂解成肽段。（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。（9）确定多肽链中二硫键的位置。,.,18,.,19,（三）测序前的准备工作1、蛋白质的纯度鉴定纯度97%以上，均一。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸2、测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数SDS-PAGE凝胶过滤法沉降系数法,蛋白质分子量=aa数目*110,.,20,四、蛋白质的二级结构,（一）概念二级结构：多肽主链骨架的局部空间构象。主要有-螺旋、折叠、-转角、无规卷曲。,.,21,构型在一个化合物分子中，原子的空间排列，这种排列的改变，会涉及到共价键的生成与破坏，但与氢键无关。构象多肽链中的一切原子，由于单键的旋转而产生不同的空间排布，这种空间排布的改变，仅涉及到氢键等次级键的生成与破坏，但不涉及共价键的生成与断裂。,.,22,（二）肽单位（肽单元）与二面角,.,23,肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单位(peptideunit)或称肽单元。,.,24,两面角（dihedralangle）在多肽链里，C碳原子刚好位于互相连接的两个肽平面的交线上。C碳原子上的C-N和C-C都是单键，可以绕键轴旋转，其中以C-N旋转的角度称为，而以C-C旋转的角度称为，这就是-碳原子上的一对二面角。,.,25,当()旋转键两侧的主链呈顺式时，规定()=0从C沿键轴方向看，顺时针旋转的()角为正值，反之为负值。和同时为0的构象实际不存在二面角（、）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。C上的R基的大小与带电性影响和。,.,26,（三）二级结构的基本类型1、螺旋（1）螺旋的一般特征（内容）：多肽链主链骨架围绕一个中心轴盘绕，形成右手螺旋手。每一螺旋圈包含3.6个a.a残基，每圈螺距0.54nm，每个aa残基沿轴上升0.15nm,绕轴旋转100。,.,27,相邻的螺圈之间形成链内氢键。氢键的方向与螺旋的方向几乎平行。与a-碳原子相连的R侧链，位于a螺旋的外侧，对螺旋的形成和稳定有较大的影响。,.,28,R侧链对-螺旋的影响多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。Gly在肽中连续存在时，不易形成螺旋。R基大（如Ile）不易形成螺旋。Pro（脯氨酸）中止螺旋。R基较小，且不带电荷的氨基酸利于螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成螺旋。,.,29,.,30,2、-折叠(-pleatedsheet)两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是-折叠片。每一个多肽链称为一个-折叠股。,.,31,.,32,平行式：所有参与-折叠的肽链的N端在同一方向。反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同反平-折叠比平行的更稳定。,.,33,3、-转角（-turn）也称-回折（reverseturn）、-弯曲（-bend）球状蛋白质分子中出现的180回折，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。转角的特征：由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。主链骨架以180返回折叠。第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键C1与C4之间距离小于0.7nm多数由亲水氨基酸残基组成。,.,34,.,35,4、无规卷曲没有规律的多肽链主链骨架构象。往往与生物活性有关,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。维系蛋白质二级结构的作用力是氢键,.,36,五、超二级结构和结构域1、超二级结构定义：在蛋白质分子中，由若干个相邻的二级结构单元（-螺旋、-折叠、-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件。,.,37,2、类型（1）aa结构（复绕-螺旋）由两股或三股右手-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。存在于-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。（2）a结构两段平行式的-折叠通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。x单位最简单的a结构是由二段平行式的-链和一段连接链组成Rossmann折叠最常见的a结构是由三段平行式的-链和二段-螺旋构成（3）结构曲折和回形拓扑结构,.,38,.,39,3、结构域（domain，motif）定义：在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。结构域一般有氨基酸残基。结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口。,.,40,六、蛋白质的三级结构：1、概念：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。三级结构是多肽链中所有原子在三维空间的排布方式。2、三级结构有以下特点：许多在一级结构上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有几个结构域。,.,41,肌红蛋白分子三级结构,.,42,.,43,3、维持三级（空间）结构的作用力：（1）氢键（2）范德华力（分子间及基团间作用力）：取向力：极性基团间诱导力：极性与非极性基团间分散力：非极性基团间（3）疏水相互作用（4）离子键（盐键）（5）二硫键，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。（6）配位键。,.,44,.,45,七、蛋白质的四级结构,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基,.,46,.,47,第五节多肽、蛋白质结构与功能的关系,.,48,一、多肽结构与功能的关系,一级结构多肽链中个别氨基酸改变可能改变功能,.,49,二、同功能蛋白质结构的种属差异与保守性,同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。,.,50,1、胰岛素一级结构比较有24个氨基酸残基位置始终不变：AB链上6个Cys不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。,.,51,.,52,2、细胞色素C一级结构对比较分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。人与黑猩猩0人与猴1人与狗10人与酵母44,.,53,生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,根据细胞色素C的顺序种属差异建立起来的进化树,.,54,三、蛋白质一级结构的突变分子病分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。镰刀形红细胞贫血,.,55,.,56,四、蛋白质前体的激活,.,57,五、血红蛋白质变构与运输氧的功能1、寡聚蛋白与别构效应别构蛋白：除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。别构效应（变构效应）蛋白质与配基结合，改变了蛋白质的构象，从而改变蛋白质的生物活性的现象。,.,58,2、血红蛋白的结构与功能（1）血红蛋白的结构：HbA：2298%，HbA2：222%接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。、链的三级结构与肌红蛋白的很相似在血液中结合并转运O2,.,59,.,60,（2）血红蛋白的氧合曲线四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S型曲线,.,61,.,62,小结蛋白质高级结构决定其功能，蛋白质的一级结构决定高级结构和功能。一级结构是空间构象的基础牛胰RNase变性-复性实验：124个a.a残基4个链内二硫键。分子量：12600(8M尿素+硫基乙醇)变性、失活透析后构象恢复，活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。,.,63,.,64,六、蛋白质的变性和复性（一）蛋白质变性的定义：天然蛋白质分子受到某些理化因素的影响时，其一级结构不变，高级结构发生异常变化，从而引起生物功能的丧失以及物理化学性质的改变。变性的因素：有物理因素和化学因素强酸和强碱；有机溶剂：破坏疏水作用；去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；还原性试剂：尿素、-硫基乙醇；盐浓度：盐析、盐溶；重金属离子：Hg2+、pb2+能与-SH或带电基团反应。高温、高压、紫外线、X-射线、超声波机械力：如搅拌和研磨中的气泡。,.,65,（二）变性表现及变性机理蛋白质变性后，往往出现下列现象：生物活性丧失物理及化学性质改变：硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。溶解度降低、沉淀，粘度增加。变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏,.,66,（三）复性：变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象,恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老,.,67,（四）新生肽的折叠分子伴侣：分子伴侣是一类在细胞内能够帮助新生肽链正确组装成为成熟蛋白质，而本身却不是最终功能蛋白质分子的组成成分的蛋白质。1.热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)HSP70、HSP40和GreE族2.伴侣素(chaperonins)GroEL和GroES家族,.,68,第六节蛋白质的物理化学性质与分离、纯化、鉴定,.,69,一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的分子量测分子量的方法：SDS-PAGE法凝胶过滤法沉降系数法和沉降平衡法,.,70,1、SDSPAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）,.,71,2、葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量,.,72,凝胶过滤的原理,当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶柱之外，随着溶剂在凝胶柱之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶柱的内外。这样由于不同大小的分子所经过的路径不同而达到分离，大分子物质先被分离出来小分子物质后被洗脱出来。,.,73,.,74,3、沉降速度法,沉降系数（S）一种蛋白质在单位离心场里的沉降速度1S=11013秒蛋白质的S值一般都在110132001013秒,.,75,（二）蛋白质的两性解离与等电点（三）蛋白质的胶体性质蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）,.,76,稳定蛋白质胶体溶液的主要因素蛋白质表面极性基团形成的水化膜非等电状态时，同种电荷的互相排斥。质点大小在1-100nm，可以进行布郎运动盐析在蛋白质溶液中，加入少量的中性盐，会使蛋白质的溶解度增加的现象，称盐溶在蛋白质溶液中，加入大量的中性盐，会使蛋白质的溶解度降低而发生沉淀的现象，称,.,77,（四）蛋白质的沉淀方法盐析法:大量的中性盐（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl，使蛋白质脱去水化层而聚集