2.蛋白质样品制备技术

第二章蛋白质样品的制备,蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具有难度的。,样品制备的原则,尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80。勿反复冻融已制备好的样品。通过超速离心清除所有的杂质。加入尿素后加温不要超过37，防止氨甲酰化而修饰蛋白。,一、样品的类型1.整体样品是生物个体小的物种（如微生物），可以整体取样。2.组织样品有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。3.细胞样品包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞）和从组织中分离同类的细胞样品。4.可溶性样品是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。,第一节样品破碎与分离蛋白质,二、组织与细胞破碎为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。,（一）温和的裂解方法通常应用于组分比较简单的样品，例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合起来应用。,1.渗透裂解非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级应用对象：血细胞、组织培养细胞。操作步骤：将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶胀而释放出细胞内容物。,2.冻融裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要求为止。,3.裂解液裂解含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。应用对象：组织培养细胞操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行悬浮处理。,4.酶裂解有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温和裂解。应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。,二、剧烈的蛋白裂解常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方法可以使细胞完全破碎裂解。,1.超声裂解法超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。应用对象：悬浮细胞操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，样品处理应在冰浴中进行。,2.压力杯法在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞。应用对象：微生物细胞，如细菌、霉菌、酵母细胞及含有细胞壁的细胞。操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷的压力杯中，施加压力，然后收集挤出液。,3.研磨法用研钵或研杵研磨细胞应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。,4.机械匀浆法使用匀浆器破碎细胞或组织应用对象：固体组织，如心脏、肝脏、肾脏组织和细胞悬液。操作步骤：先尽量将组织剪成块，然后加有蛋白酶抑制剂的冷匀浆液进行匀浆，过滤或离心收集。,5.玻璃珠匀浆法剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物应用对象：细胞悬液或微生物操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子里。每克细胞（湿重）加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min，冰浴1min。重复上述步骤。,三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白酶抑制剂。,PMSF(苯甲基磺酰氟）是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。AEBSF为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L，作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。,金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA）乙二醇双四乙酸（EGTA）通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。肽蛋白酶抑制剂亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatinA），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。,甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。Benzamidine通常浓度为1-2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。变性剂在低温条件下处理。直接加入强变性剂8mol/L脲、10TCA或2SDS。强碱下抑制酶活，许多组织蛋白酶在pH超过9.0的时候失活。,四、蛋白质沉淀步骤这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。,硫酸铵沉淀（盐析）原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。步骤：蛋白浓度大于lmg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L,并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min，通过离心沉淀蛋白。然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干扰IEF,必须被清除。,TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCA加到提取液中，终浓度将高达10-20。蛋白质可于冰上沉淀30min。另外，组织样品可以直接用10-20的TCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉淀，以除去TCA。然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完全再溶。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。,丙酮沉淀这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多杂质，如去污剂、脂类。于提取物中加入至少3倍体积的冰丙酮，使蛋白在-20沉淀至少2h，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮通过空气干燥或冻干除去。,在丙酮中用TCA沉淀两者联合应用更加有效，通常用10TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.01-巯基乙醇溶液或20mmol/LDTT）。至少在-20沉淀45min，通过离心沉淀蛋白，并用含0.01-巯基乙醇溶液或20mmol/LDTT的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。,用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀这对于杂质含量高的植物样品很有效。蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时较多。,在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。,第二节蛋白质裂解技术,一、裂解液在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向电泳分离效果的一个有力措施。,离液剂尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为8mol/L。尿素可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。,还原剂还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的还原剂有-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常用的是DTT。,去污剂去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂NP-40和TritonX-100，两性离子去污剂CHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移位置。最初，两个相似的非离子去污剂NP-40和TritonX-100被广泛应用。随后研究表明：兼性离子去污剂CHAPS的效果更好。,通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。,第三节样品预分级,一、亚细胞器的分离主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组分。细胞匀浆取待分析的组织细胞样品以0.9NaCl溶液反复清洗，加入SE缓冲液（0.25mol/L蔗糖、1mmol/LEDTA)，在低温下研磨成匀浆备用。,亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离1.差速离心指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在不同离心力场的作用下沉降而分离。2.密度梯度离心指用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层分离。速度沉降分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降。等密度沉降平衡适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。,二、分步裂解提取,1.目的与原理由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相pH梯度的等电聚焦中有待进一步的研究。,2.方法Molley等(1998)首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：水溶液的提取约5-15mg细胞中加入2ml裂解液（40mmol/LTris）。反复冻融3-4个循环，加入适量的DNase和RNaseA，震荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取向第一步的沉淀中加入500ul的裂解液（8mol/L的Urea，4CHAPS，100mmol/LDTT,40mmol/LTris，0.5Pharmalyte3-10，20ug/mlDNase和5ug/mlRNaseA）剧烈震荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。,含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取将上一步所余的沉淀用40mmol/LTris清洗后，加入200ul裂解液（5mol/LUrea，2mol/Lthiourea，2CHAPS，2SB3-10，2mmol/LTBP,40mmol/LTris,0.5Pharmalyte3-10,20ug/mlDNase和5ug/mlRNaseA)剧烈震荡混匀，离心后收集上清，保存于-70,分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液只含有40mmol/LTris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二步裂解液属传统的裂解方法，含有表面活性剂CHAPS、还原剂DTT、解聚剂Urea等成分，由于具有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白、第三步裂解液中添加了能够促进疏水蛋白质溶解的成分，如表面活性剂SB3-10、还原剂DTT、解聚剂thiourea，主要溶解偏疏水性的蛋白。,细胞器蛋白质的提取膜蛋白的提取与分离核蛋白的提取与分离,三、特殊蛋白质的提取,第四节样品蛋白质含量测定,1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术,被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。,微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量,蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,Folin酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20g/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝,总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）,基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。,BCA蛋白质检测流程：,考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,CoomassieDye-Based蛋白质定量,三、操作方法1.标准曲线制作取14支试管，分两组按下表平行操作。试管编号0123456标准蛋白含量(g)0102030405060标准蛋白溶液(mL)00.010.020.030.040.050.06待测蛋白质溶液(mL)蒸馏水(mL)0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂(mL)2.5mL摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。,2.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。,四.注意事项,（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。,样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分离及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备中需考虑清除这些杂质。盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子盐离子会干扰电泳过程，应尽可能保持低浓度或加以清除。通常用透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀/悬浮的方法进行脱盐处理。,第五节清除影响电泳的图谱的杂质,内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）这些物质通常带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全。通常用TCA/丙酮沉淀除去这些物质。离子去污剂离子去污剂，如SDS，通常用于蛋白的提取和溶解，但却强烈干扰IEF。SDS与多肽形成复合物。如果SDS不被除去，则不能正确聚焦。通常用含有兼性离子去污剂或非离子去污剂的重泡胀溶液稀释含SDS的样品。通过丙酮沉淀也可以去除部分SDS。,核酸（RNA、DNA）核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散；高分子质量的核酸能够阻滞凝胶孔径；核酸可能通过电稳态相互作用与蛋白结合，从而阻碍聚焦；如果分离的蛋白通过银染检测，凝胶的核酸也将染色，导致高背景。通常可用DNase/RNaseA混合物处理样品中的核酸，将其变为单或寡核苷酸。常用0.1倍体积的含有1mg/mlDNase、0.25mg/mlRNaseA的溶液和50mmol/LMgCl2溶液在冰上孵育。然而DNase/RNaseA也可能出现在电泳图中。超离可以除去大分子核酸，然而，也会除去高分子量蛋白。但应用低离子强度的提取液时，带负电