大肠杆菌分子克隆载体ppt课件

.,第三节大肠杆菌分子克隆载体,.,一、E.coli克隆载体的种类1.质粒载体复制起点来自一些天然质粒。2.噬菌体载体，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。3.COS质粒载体质粒载体中插入cos片段，以利于体外包装4.噬粒载体（phagemid）有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。,.,二、质粒与质粒载体1.Ecoli的质粒种类1)colE1因子（大肠杆菌素因子）多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。2)R因子（抗药性因子）可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便3)F因子（性因子）,.,2.质粒的特点1)质粒DNA复制与染色体复制无关2)质粒DNA以超螺旋形式存在3)质粒DNA可以接合转移4)质粒的不相容性和不相容群5)质粒DNA的消除化学和物理法(吖啶染料，EtBr，高温等)6)质粒的整合F因子又可整合到E.coli染色体中3.质粒DNA的转移1）质粒DNA的转移过程,.,质粒的自主转移过程,.,质粒DNA的转移和复制,.,2）质粒转移的必备条件.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点顺式作用（cis-action）ii.细胞附属物性纤毛，由蛋白质构成反式作用.转移过程所需的全部酶类反式作用3）质粒转移类型.自我转移（Self-transmissible）.辅助转移（Donation）可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。.重组转移（conduction）若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。,.,质粒自主转移,质粒的辅助转移,质粒的重组转移,R-重组DNA分子,.,4.质粒DNA的复制和调节控制1)复制机制复制方向、终止和方式2)质粒拷贝数的控制抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。3)质粒的复制调控机制例子:ColE1质粒的复制及复制起点结构Borosetal.(1984)分离到一个pBR322突变体，其拷贝数可达1000/cell或65%总DNA，原因是在RNAI基因的3端附近发生一次GT颠换。,.,ColE1质粒复制起点结构,质粒DNA的复制过程,.,5.大肠杆菌质粒载体1)常用质粒载体的复制子质粒载体复制子来源拷贝数pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A10-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-202)质粒载体常用的遗传标记基因AprCmrKanrNeorTcrHygrLacZLacZ3)多克隆位点区大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的,.,6.实例pUC18和pUC19pUC系列质粒载体由Messingetal.构建，具有三个显著特点：1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大2）易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ3）多克隆位点区.多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列顺序相同，但方向相反。这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入.产生不同末端规律排列:两端限制酶位点产生5突起端（EcoRI和Hind），与之相邻的两个限制酶位点产生3突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限制酶位点产生5突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。,.,pUC18和pUC19载体,.,如插入片段的5段定向缺失:XbaISphIExoS1T4DNAlingase;插入片段的3-端亦可采用类似的方法进行缺失（SmaISstIExoS1T4DNAlingase）不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如:pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)：假设有一EcoRIHindDNA片段，并要求在其3-末端或5-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子），显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。.多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的绘制。除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源基因（LacZ启动子）。,.,pBS载体的结构,.,三.噬菌体载体1.噬菌体载体1）的结构和特点i.一般结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t5-突起（5-GGGCGGCGACCT-3）该末端称为cos位点，可被编码的末端酶所识别（该酶由末端的两个基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成）ii.基因结构46个基因，分为以下四类：)调控基因：C、N、CI、Cro、C决定进入溶源化还是裂解状态)DNA复制：O、P、Q)重组：int、xis、red和gam)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、Sii.可以低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中,又可以烈性噬菌体形式进行复制;iii.P1噬菌体包装原理:渐进满头机制（processiveheadfulmechanism）底物:滚环复制过程形成的头尾相连串状体,.,包装过程:始于一个长162bp的P1pac位点，识别和切割此位点的是P1编码的pacase，切出的pac一端进入预制头部，当其头部充满DNA后，DNA再次被切。第二次切割是随机的，无特异性DNA序列。第二轮包装则从非特异性切割出的末端开始。因此，多次包装都是从一个pac位点开始的。P1头部可容110Kb。pac位点:一端含4个六聚体(5TGATCA/G3)，另一端则有三个，中间区域长90bp，pacase切点位于靠近90bp区的中心序列。每个六聚体都有一个腺嘌呤甲基化位点(damGATC),pacase只作用甲基化的pac位点.,.,大肠杆菌P1噬菌体基因组和包装,.,2)P1载体-pAd10sacBi.优点i)可克隆较大插入片段,可插入95Kb外源DNA，二倍于cos质粒载体ii)较高的转化频率,12g载体+24g外源DNA105转化子iii)与YAC载体相比，它易于产生多拷贝的基因组片段;易于获得大量特定的克隆DNA;克隆过程更可靠;克隆片段易于进行次克隆ii.结构载体被二个loxP重组位点分隔为两区Ampr和Kanr区Ampr区：来自pBR322的ori,pac位点(反时针包装),来自腺病毒的11Kb填充片段(插入到Sca位点)Kanr区：Kanr(Tn903)和Tetr基因，P1质粒复制子和分离系统，P1裂解复制子，其活性受lac操纵基因启动子控制,.,大肠杆菌P1噬菌体载体pAd10sacB,.,P1噬菌体载体构建基因组文库的示意图,pAd10sacBScaI+BamHI长臂+短臂加入外源DNA片段重组DNA分子离体包装感染宿主细胞,.,SacB基因:编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶，当含该基因的细胞培养在2%以上蔗糖培养基中时,果聚糖积累在细胞周质空间内，导致大肠杆菌细胞死亡SacB基因被克隆到原Tetr基因的BamHI-SalI间,在其上游加上E.coli基因启动子,克隆位点BamHI位于这两个DNA片段间,外源DNA片段插入时可进行显性筛选重组子为了使sacB基因自发突变减小到最小限度,sacB基因上游还有一个P1C1阻遏物结合位点与其启动子重叠。凡是表达P1C1基因的细胞，sacB基因表达受阻，在无蔗糖条件下，这种细胞会生长得更好iii.克隆策略3.3kb短臂：含pac,loxP,无启动子的sacB26kb长臂:含P1裂解复制子，Kanr，P1质粒复制子，loxP位点,.,包装:重组DNA分子先用pacase或抽提物酶切pac位点，然后用抽提物（含头部和尾部）进行包装直至头部充满DNA，最后与尾部相连成有感染力的重组P1噬菌体颗粒。iV.重组DNA分子形成当重组DNA分子进入宿主细胞后，特异性位点重组发生在两个方向相同的loxP位点，该过程由宿主细胞表达的重组酶（Cre）催化v.宿主菌E.coliNS3529菌株基因型recA-，lacq，mcrABC，mrr:recA-:防止插入DNA片段内的同源重组，以免发生重排;lacq:抑制P1裂解复制子的激活,使P1质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在，亦防止外源DNA分子重排;mcr和mrr:抑制富含GpMeC或ApMeC插入片段的选择性丢失,.,3.M13和fd载体1)结构特征环状ssDNA，病毒颗粒呈丝状2)复制过程：ss（+）RF(0-1min)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min)DNA包装无严格限制3)生活史a.病毒粒子靠小分子衣壳蛋白和A蛋白附着于性纤毛顶端（E.coli中F因子提供）b.病毒DNA和A蛋白进入细胞内，大部分衣壳蛋白则留在细胞膜上c.病毒DNA变为双链复制形式（RF）,衣壳蛋白可能为DNA复制提供附着位点d.RF进行滚环复制，形成单链，同时基因与蛋白质结合e.ssDNA环化，并形成线状的DNA基因与蛋白质复合物f.病毒DNA穿膜时，基因与蛋白质被附着于膜上的衣壳蛋白取代，完整病毒从细胞中释放，释放时不杀死细胞，但因感染细胞生长缓慢，仍然可见噬菌斑,.,M13噬菌体的生活史,.,1）基因结构基因、和编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装基因参与DNA复制基因、和编码M13的结构蛋白基因参与单链复制过程中的环化作用基因是衣壳蛋白的重要组成部分2）M13mp系列载体a.特点：在IR区中插入一个lacZ基因，然后在该基因中逐渐构建一个多克隆位点区，ds-DNA可用常规方法直接导入，ss-DNA常用感染的方法噬菌斑的形成用于选择DNA导入的细胞，在X-Gal平板上形成的无色噬菌斑检测重组子b.优点：易于获得ss-DNA用于DNA序列测定和基因突变，从细胞中易于检测分离到RF型的ds-DNA用于外源DNA重组M13mp系列载体的多克隆位点区,.,四.COS质粒载体1.结构特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自的cos位点片段,双cos载体比单cos载体易于重组lcos位点的精细结构cos长200bp，由以下几个亚单位组成：a.cosN由末端酶的gpA亚基识别和切割，产生5-12n.t突起；b.cosB分别位于cosN的两侧，称之为cosBL（左侧）和cosBR（右侧），为蛋白质结合位点。R1、R2和R3长16bp，其中有12个n.t相等，可与gpNul蛋白进行体外结合。R4与上述三个R片段仅有8个n.t相等，不能与gpNul蛋白进行体外结合，但可以和全酶结合（ATP存在时）。I1为IHF结合位点。,.,COS位点的结构,.,2.优点.容量大（可达48kb），用于基因簇的克隆.形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）.操作简便，可直接转化细胞.对重组DNA分子长度具有选择性包装3.遗传标记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选择转化子