微孔板检测技术的原理和应用PPT课件

微孔板检测技术的原理和应用,张智彧应用工程师,原理及应用介绍大纲,光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例,光的物理简介,光的本质光的性质,光的本质,一种能量电磁波电子能级（轨道）波粒二相性衍射光电效应,红外线,光的性质,基本性质速度：3108m/s波长：颜色频率：能量E=h其他性质偏振荧光：激发,c=,光的性质,物体的颜色白光是复合光单色光互补色光溶液的颜色由溶液中的质点（分子，离子）吸收特定波长的光，透射其互补色的光吸收曲线,KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4:abc200nm）光谱窄发光时间长,Eu:激发波长320nm，发射波长612/620nm,时间分辨荧光（TRF）,和普通荧光相比，排除了背景光干扰所有普通荧光强度（FI）检测，如干扰影响极大，无法排除，均可采用时间分辨荧光标记来解决,以荧光为基础的检测技术,荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT),用FI的方法检测分子间结合,缺点：1、步骤繁琐，需要洗涤2、且每次洗涤强度很难一致，造成结果有差异，重复性差。,优点：1、步骤简单，无需洗涤2、试验均一性，重复性好,荧光偏振（FP）的原理,光的偏振性,荧光偏振（FP）的原理,如果荧光基团在处于激发态的时间内（如Fluorescein为4ns)保持静止，那么它发射出的荧光也是与激发光是同平面的,荧光偏振（FP）的原理,如果荧光基团在处于激发态的时间内是运动状态，那么它发射出的荧光会发生偏振平面的改变,荧光偏振（FP）的原理,荧光偏振改变反映了分子的运动状态，也可以说反映了分子所处的环境的状态分子运动快，偏振方向改变大分子运动慢，偏振方向改变小荧光偏振：分子运动越快，P值越小分子运动越慢，P值越大,荧光偏振（FP）的原理,分子体积与运动速度的关系体积越大，运动速度越慢体积越小，运动速度越快分子所处环境与运动速度的关系溶液的粘稠度利用荧光偏振的特性可以研究相互作用分子结合，体积改变，运动速度变化，P值相应发生变化溶液状态变化，溶液的粘稠度改变，其中的分子运动速度变化，P值相应发生变化,荧光偏振（FP）研究分子相互作用,原则荧光基团标记在小分子上，偏振值低当小分子与较大的分子结合后体积增加，偏振值增加偏振值的大小反映了两个分子之间的结合效率与结合数量,荧光偏振（FP）研究分子相互作用,配体受体结合蛋白质与蛋白质结合抗原抗体结合蛋白质与DNA的相互作用DNA杂交酶活性检测膜的流动性分析,Estradiol与EstradiolReceptor,ER：能和小分子疏水配体结合的核受体超家族成员，穿梭于胞浆和胞核内，具有转录因子的作用（DNA结合），包括ER、ER两种亚型Estradiol（雌激素）：与ER结合，引起其入核，调节基因转录Estradiol类似物,ER-竞争性结合物的筛选,雌激素受体ER-竞争性结合物可作为候选的药物成分具体步骤荧光标记的雌激素ES2与ER-结合，复合物较大，P值较大加入竞争物之后，则能够将ES2替换下来，单独的ES2体积小，P值减小P值的减小程度与竞争物的浓度的关系反映了竞争物的竞争性,ER-竞争性结合物的筛选,Estradiol-ER与DNA结合,ER核受体，Estradiol与DNA结合，调节基因转录传统方法EMSA放射性，繁琐,Estradiol-ER与DNA结合,荧光偏振方法亲和层析纯化ERFAM标记的DNA结合序列偏振分析,激酶活性分析,竞争性免疫分析检测激酶活性被激酶磷酸化的产物与荧光标记的磷酸化示踪物竞争磷酸化抗体荧光标记的磷酸化示踪物与抗体结合后荧光偏振值增加激酶活性决定了磷酸化产物比例，荧光偏振值增加的程度与激酶活性成反比例抑制物对激酶活性的影响,激酶活性分析,蛋白酶活性分析,蛋白酶将大分子的蛋白切割成小的片断，荧光偏振值变小研究蛋白酶的动力学参数,偏振中数据处理问题,G值仪器分别测量与激发光偏振平面平行和垂直的偏振光时，使用相同但是不是同一个光学元件校准，使用已知偏振值的荧光物质及其相应的缓冲液计算G值。P实际GP测量G(RFUBUF)(1Pref)/(RFUBUF)(1Pref),偏振中数据处理问题,只有当被测样品的信号变化比对照组（正C+、负C-）有足够的标准偏差，结果才有意义。,偏振中数据处理问题,荧光偏振优势,均相(无分离/洗涤）在溶液中进行，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度/强度无关无破坏性(可重复测量)无放射性可实现高通量,荧光偏振缺点,FP使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein,TAMRA)，它被限定为：荧光标记的小的配体（如抗原）和大的受体（如抗体）的结合。检测依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变。,以荧光为基础的检测技术,荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT),荧光共振能量转移（FRET）,FRET：一对合适的荧光物质，前者的发射波长正好是后者的激发波长，当二者达到一定的分子距离时（19nm），供体发出的光子能量会传递给受体分子，受体被激发，发射荧光供受体的激发光谱要分得足够开供体的发射光谱要与受体的激发光谱重叠供受体的发射光谱要分得足够开,荧光共振能量转移（FRET）,荧光能量传递的效率与分子间的作用距离相关因此能量传递的发生及强度可以作为分子间发生相互作用以及相互作用强弱的指示特征,FRET的应用,分子间相互作用药筛模型蛋白质与核酸的结构和构象研究/蛋白质复合物的分配与组装测量DNA寡聚体的结合（溶液中DNA杂交的动力学测量）膜融合研究分子内和分子间的距离测量标记的大分子上特定位点的距离测定供体和受体的距离，受体/配基相互作用,激酶反应检测,FRET荧光素对标记底物分子位点特异性的酶不能切开被激酶磷酸化的底物，保持FRET；磷酸化的底物失去FRET测量Donor的发射光（445nm）和Acceptor的发射光（520nm），计算比值445/520。比值越大，激酶活性越强,FRET的优势,均相检测(无分离和洗涤步骤)在溶液中进行，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单可以很好地观察活细胞内酶活性变化，并且能做到定时、定量、定位，是一种非常有效的研究手段无放射性,FRET的缺点,供体与受体的距离限定为10-80，而许多生物结构（如蛋白-DNA复合物，大的蛋白，膜等）为80-130信噪比经常不佳，通常为1：1；背景噪声来自供体荧光干扰及受体被直接激发供体与受体浓度的比率很关键必须有两种荧光标记,以荧光为基础的检测技术,荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT),均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET),结合TRF与FRET，选择发光时间长的稀土元素作为Donor，使得Acceptor的发光时间更长选择检测时间，避开激发光和Acceptor直接被激发的发光时间区域解决信噪比问题,应用实例：cAMP浓度检测,cAMP重要的第二信使传统的报告基因方法HTRF供体:抗cAMP抗体用铕螯合物Eu(K)标记受体:cAMP用XL665(Allophycocyanin)标记样品分子:处理后的细胞裂解物cAMP与标记的cAMP竞争结合抗体计算受体发射光与供体发射光的比值，比值越大则细胞中cAMP的浓度越低,应用实例：cAMP浓度检测,由于Eu元素的荧光寿命较长，当FRET效应存在时，会使得XL665也保持较长的能量衰减时间,EnergyTransferfromEutoXL665,应用实例：cAMP浓度检测,如果不存在FRET效应，激发光直接激发APC，APC所发出的是一个短寿命的荧光,NoEnergyTransfer,应用实例：cAMP浓度检测,NoEnergyTransfer,对于部分没有结合的Eu标记的抗体分子，同样会被激发出长寿命的荧光,均相时间分辨荧光的优势,镧系元素标记，能量传递效率更高，放大了所能检测到的作用距离范围(100-200)，提高了检测的灵敏度及应用范围时间分辨的检测方法，可极大地降低背景荧光的干扰，提高信噪比均相，操作简单快速，仅需三个步骤:加样，孵育，测量采用比率计算，更为准确，降低了系统误差,以荧光为基础的检测技术,荧光强度(FI)时间分辨荧光(TRF)荧光偏振(FP)荧光共振能量转移(FRET)均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET)荧光寿命(FLT),荧光寿命（FLT）,荧光寿命：荧光分子在回到基态之前之前维持激发态的平均时间一般在ns范围内荧光寿命受到许多条件的影响，可作为一种分子状态（环境）改变的标志检测速度是其他方法的几百万倍对分子进行动态监测，时间显微技术,荧光寿命（FLT）,I(t)=I0e(-t/t)荧光寿命：当荧光强度衰减到最高值的1/e时（一般是37%)所经过的时间外界环境和分子自身的状态变化影响荧光寿命=1/(krad+knonrad),使用FLT筛选药物,快速，高通量筛选人类凝血酶抑制子已知aptamer是一种有效的抑制因子用IRIS-5标记aptamer，与凝血酶结合或分离表现不同的荧光寿命代筛选的物质与aptamer竞争凝血酶导致aptamer的分离改变荧光寿命,使用FLT筛选药物,筛选窗口FP验证,荧光技术总结,FI，TRF相对而言是一项异相操作技术，相比均相检测技术较为烦琐，但应用范围更广，操作灵活FP、FRET、HTRF均是均相分子检测技术，摈弃了异相操作的烦琐步骤、洗涤条件的严格控制、结果的不均一化等条件的限制FP技术整体操作简单易行，所耗试剂成本较低，而且可以进行动力学计算，但容易受一些外界因素影响（背景干扰，溶液离子环境）、检测范围相比而言较窄（分子量的限制）FRET技术相比FP而言可进行活体检测，是一项动态分析检测技术，可以计算分子间相互作用的平衡常数以及反应速率。但试剂成本较高，而且容易受直接激发干扰，分子间的检测距离也往往受到一定的限制。,荧光技术总结,HTRF技术能解决分子间检测距离的限制，也基本不受溶液离子环境，温度、背景荧光，激发光等的干扰，且能排除加样体积等的影响HTRF采用的是比率计算，从而消除了分子浓度不均一等造成的系统误差。因此相比而言，HTRF是一项信噪比绝佳的荧光分析技术。而且HTRF还是一项动态分析检测技术FLT是一项新技术，以其检测敏感，时间短和高通量为优势，但是对仪器配置要求很高,原理及应用介绍大纲,光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例,发光原理,发光：与荧光类似，同样是由于电子的跃迁产生的，但促成电子的跃迁的能量不是由光源直接激发造成的，而是来源于反应中产生的能量化学发光是能量来自于化学反应引起的发光生物发光是能量来自于酶促催化下的生化反应引起的发光分类连续发光型（辉光型）：发光长效持久，无需自动加样器。(eg.Alkalinephosphatase)瞬时发光型（闪光型）：发光时间短，变化快，需使用自动加样器。(eg.Aequorin),发光原理,发光的应用领域,报告基因检测化学发光免疫分析核酸定量(PCRQuantification)酶活分析活性氧分析BRET分析,报告基因检测,评价启动子调控效率和其中作用元件的有效方法双报告系统同时向细胞中转入两种报告基因其中一种为待研究的启动子控制（荧火虫荧光素酶），另一种为不被处理所影响的启动子控制（海肾荧光素酶）作为内参消除系统误差,报告基因检测,Transfectcells,分别将两个载体中的SV40启动子替换成一个目标启动子和一个内参启动子,分别测量两个报告系统中luciferase表达量,将结果用内参均一化（比值）,报告基因检测,得出报告基因活性在不同条件下的相对值,报告基因检测的优势,减小随机误差比率计算避免了系统误差超高的灵敏度（极低的背景干扰）动力学范围更广发光强度在46个数量级之间与测定物质浓度间呈线性关系无需昂贵的设备投入手段更为灵活,生物发光共振能量传递（BRET）,研究分子间相互作用,EnergytransferfrombioluminescentDonorfluorescentAcceoptorDonor=Renillaluciferase(Rluc)Acceptor=GreenFluorescentProtein(GFP),生物发光共振能量传递（BRET）,BRET的应用领域,蛋白组学监测蛋白-蛋白相互作用检测胞内细胞器间的相互作用在哺乳动物细胞中对酵母双杂交结果的验证受体研究细胞信号传导通路研究,BRET的优势与缺点,优势避免了光漂白信号稳定：可维持1小时分析方法灵活缺点步骤繁琐，难度高在细胞中要同时表达两种蛋白融合蛋白,总结,各种技术的影响因素,.,102,GeniosPro,检测模式及仪器特点主要竞争产品分析,.,103,GeniosPro之检测模式及仪器特点,检测模式应有尽有堪称全能战士：光吸收（2301000nm）荧光强度（230900nm）荧光偏振(275750nm)时间分辨荧光均相时间分辨荧光底部阅读荧光共振能量转移FRET化学发光：连续和瞬时化学发光共振能量转移BRET双报告系统：Chroma-Glo,.,104,GeniosPro之检测模式及仪器特点,仪器设计独到巧妙堪称滤光片系统的精致之作每一个细节都体现着精致：光源：高能闪烁氙灯检测范围更广，从紫外区到远红外区使用寿命更长（可闪烁1百万次以上）无需预热，工作状态更稳定适合瞬时检测,.,105,GeniosPro之检测模式及仪器特点,每一个细节都体现着精致：光路：发光、顶部和底部阅读各自采用独立的光路系统，避免了相互干扰无光纤，内置多个二分镜，由二分镜分光，最大限度的减少了光传播途径中的能量损失。,.,106,GeniosPro之检测模式及仪器特点,每一个细节都体现着精致：检测器：光吸收、荧光和化学发光检测分别由三个各自独立优化的检测器完成：光电二极管：检测范围广，满足4O.D以下的吸收光检测低暗电流PMT：具有大光敏面积，适用于各类荧光检测单光子计数PMT：用于化学发光及BRET的检测，具有增益值高、暗电流小、噪声低、时间分辨率高、量子效率高、红光敏感等特点。（其他产家产品多数只有两个探测器，一个针对光吸收，一个针对荧光，兼顾较强的化学发光）,.,107,GeniosPro之检测模式及仪器特点,每一个细节都体现着精致：滤光片滤光片分组放入条形架中，可随意插入，取出，既保护了滤光片，又使滤光片更换象更换电脑软盘一样方便。每台机器可自定义多达42片滤光片，充分满足科研需要。（PE,BMG,Berthold都是滤光片轮，更换时需旋下滤光片）,.,108,GeniosPro之检测模式及仪器特点,每一个细节都体现着精致：底部与顶部阅读只需软件设置，无需手动更换附件内置式加样器美观适用用于各种快速动力学加样，瞬时反应加样,.,109,GeniosPro之检测模式及仪器特点,每一个细节都体现着精致：超强化学发光配置专配滤光片轮可倍比弱化过强发光，扩大检测线性范围可增加检测功能（如双报告基因检测，BRET检测）Z轴可调在不同液面高度的检测中均能找到最佳测量位置，得到最强的信号,Infinite200系列酶标仪,特点:经典双子座,无限自由风,配置最灵活的高端全能型酶标仪配置最灵活可选择F200滤光片型或M200光栅型；八种模块自由选择功能全面九种功能模式高端性能FI/Lum等灵敏度处于高端水平直观化操作性价比优异,F200滤光片型或M200光栅型可选，检测器、温控可选荧光顶部（包括TRF、FRET）荧光底部（包括TRF、FRET）普通PMT（upto600）或扩展波长的PMT（upto850）光吸收发光（包括双色发光）加样器（12个）温度控制荧光偏振（F200），光吸收的比色杯光路（M200）,特点配置最灵活,特点功能全面,光吸收（Abs）荧光强度（FI）瞬时荧光（FlashFI）荧光共振能量传递（FRET）时间分辨荧光（TRF）连续发光（GlowLum）瞬时发光（FlashLum）双色发光（Dualcolorlum）荧光偏振（FP，F200型），荧光/光吸收扫描(FI/Absscan，M200型),特点可配加样器，支持快速动力学,可配12个加样器（放在主机上面或侧面），适用于所有检测模式回流功能，有效节约试剂加样器放在封闭不透明的小箱中，液体管道不透明，有效地避光保护光敏感试剂两根针的距离小于384孔直径，因此对于所有孔型（6384）都可以用双针对单孔加样面板上自带灌注和清洗键，无须通过