表面等离子共振 (SPR) 技术与Biacore原理

表面等离子共振(SPR)技术与Biacore原理,戴璐,.,表面等离子共振(SPR)原理,表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)消逝波：当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大到某一角度，使折射角达到90时，折射光将完全消失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。当以波动光学的角度来研究全反射时，人们发现当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝波。,.,表面等离子共振(SPR)原理,等离子波：把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，这实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行，进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为等离子波。,.,表面等离子共振(SPR)原理,SPR光学原理：光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质中又存在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，使反射光完全消失的入射角就是SPR角。SPR角随金膜表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金膜表面结合的分子质量成正比。因此可以通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取分子之间相互作用的特异信号。,.,SPR生物传感器,SPR生物传感器的光源为偏振光(polarizedlight),传感芯片(sensorchip)表面镀有一层金膜,实验时,先将一种生物分子(ligand)固定在金膜表面,然后将与之相互作用的分子(analyte)溶于溶液(或混合液)流过芯片表面。SPR检测器能跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化,不同角度的反射光的光强被记录后得到角度-光强曲线图,每条曲线的波谷即为该曲线的共振角,共振角对应的角度为共振信号(resonancesignal),时间与对应共振信号的曲线即为SPR传感图(sensorgram)。,.,SPR生物传感器,以免疫学分析为例,在金膜表面固定某种受体(如抗体),然后流过含相应配体(如抗原)的样品,配体与受体的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升,从而导致共振角发生变化。为了表述的方便,共振角(或共振信号)可以用共振单位(resonanceunits,RU)来表示。对大多数生物分子而言,1000RU大约等于1mm2的面积上有1ng的质量变化，相当于溶液中蛋白浓度为6mg/ml。SPR生物传感器通过检测获得共振角的改变程度,便可以对配体浓度进行定量。,.,SPR生物传感技术的应用领域,生物大分子的相互作用：肿瘤研究免疫学和传染病神经科学生物制药蛋白质组学,.,Biacore可研究的生物分子范围,蛋白质DNA/RNA脂类/脂质体/生物膜多糖多肽小分子全细胞/病毒/微生物,.,可分析的对象,.,Biacore核心组件,.,Biacore提供的生物分子相互作用信息：,有无结合(YesorNo)结合的特异性和选择性(Specificity)两种分子的结合强度-亲和力(Affinity)结合和解离的快慢和复合体的稳定性-动力学(Kinetics)功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序(Mechanism)分子结合的温度与热力学特征(Thermodynamics)目标分子活性含量的检测(Concentration),.,SPR光学组件,.,微流控系统(IFC),集成化、自动化的微流路控制系统样品消耗量低为互相作用分析而设计优化,.,微流控系统(IFC)流动池,IFC上有4个流动池可选择单独、配对、串联使用。流动池为配对使用进行了优化(Fc1-Fc2,Fc3-Fc4),.,传感芯片,.,传感芯片,.,葡聚糖表面,亲水性温和型:和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相似非特异性结合量低高结合容量易于进行共价结合出色的化学稳定性,.,传感芯片的选择,11种不同的芯片种类CM5,CM4,CM3：芯片蛋白、肽段、小分子等CM7：小分子化合物研究SA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等BiotinCAP芯片：可逆性生物素捕获芯片NTA芯片：His重组蛋白L1芯片：模拟脂质双分子层环境HPA芯片：实现膜系统相关的互作分析C1芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子Au裸金芯片：客户定制表面（材料、高分子等）30余种不同的试剂盒及缓冲液产品：氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒；GST捕获试剂盒GST重组蛋白分析；NTA捕获试剂盒His重组蛋白分析；,.,最常用的传感芯片：CM5传感芯片,.,Biacore实验的基本流程,.,分析物和配体的定义,固定配体(Immobilization)：,.,样品进样(Injection),分析物(Analyte)进样后，以恒定的流速和浓度流过芯片表面样品中的待分析物与固定在芯片表面上的配体发生结合，芯片表面物质的质量发生改变，仪器记录下对应的响应值(response)的改变进样结束后，切换缓冲液流过芯片表面，分析物由配体上自发解离，解离的进程由响应值实时监控。,.,芯片再生(Regeneration),将自发解离后仍然结合于配体的分析物彻底洗掉。配体的结合活性必须保留。,.