chapter8亲和层析.ppt

8亲和色谱,亲和层析是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。生物亲和作用（bioaffinity)简称亲和作用（affinity)，是生物分子间特异性相互作用。利用生物亲和作用的高度特异性与其他分离技术如膜技术、双水相萃取、反胶团萃取、沉淀分级和电泳等相结合，出现了亲和过滤、亲和分配、亲和反胶团萃取、亲和沉淀等亲和纯化技术。,8.1生物亲和作用,8.1.1亲和作用的本质钥匙和锁孔的关系相互作用：静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键,8.1生物亲和作用,生物体内相互作用的分子对：(1)酶底物或抑制剂或辅酶(2)抗原抗体。(3)激素受体。(4)糖蛋白与凝集素,(5)生物素生物素结合蛋白等,8.1生物亲和作用,8.1.2影响亲和作用的因素离子强度pH值抑制氢键形成的物质温度离液离子螯合剂,8.1生物亲和作用,8.1.3亲和作用体系,8.1生物亲和作用,8.2亲和色谱原理,许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力称为亲和力。依据生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，采用一定技术，把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相后，可把目的产物从混合物中分离出来，此中分离技术称为亲和层析。,在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶性母体上。母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酞胺凝胶和纤维素等。当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与配基之间引入适当长度的连接臂。,要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶联，必须先使母体活化。即通过某种方法(如溴化氰法、叠氮法等)，使母体引入某一活泼的基团，才能以共价键与配基偶联。活化后的不溶性母体已有商品出售。商品名为偶联凝胶。,亲和色谱（Affinitychromatography）,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,8.2亲和色谱原理,图8.2亲和色谱操作示意图,图8.2所示为亲和层析分离示意图。把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能的情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入层析柱中（如图8.2中a），然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条件下进入层析柱。这时，混合液中只有能与配基发生结合反应形成络合物的目的物质（图8.2中分子）被吸附（如图8.2中b），不能发生结合反应的杂质分子（图8.2中分子）直接流出。经清洗后，选择适当的洗脱液或改变洗脱条件进行洗脱（图8.2中c），使被分离物质与固定相配基解离，即可将目标产物分离纯化。,8.2亲和色谱原理,8.2亲和色谱原理,一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的亲和吸附介质（固定相）。固体粒子称为配基的载体。作为载体的物质应具有：不溶性的多孔网状结构，渗透性好；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；具有亲水性，无非特异性吸附；含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固定化；抗微生物和酶的侵蚀；最好为粒径均一的球形粒子。常用的载体有葡聚糖、聚丙烯酰胺等，近年来多孔硅胶和合成高分子化合物载体正在被开发应用于亲和层析。,8.3亲和色谱介质,可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose1B到10B,基质的选择,理想的基质应满足以下要求：高度的亲水性。极低的非特异性吸附性（惰性）。具有足够的化学基团。适当的多孔性。较好的理化稳定性。,一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。优良配体须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与基质共价结合的基团。,配体的选择,目的产物与相应的配基,8.3.1亲和配基酶的抑制剂抗体A蛋白凝集素辅酶和磷酸腺苷色素配基过渡金属离子组氨酸肝素,8.3亲和色谱介质,亲和配基可选择酶的抑制剂、抗体、蛋白质A、凝集素、辅酶和磷酸腺苷、三嗪类色素、组氨酸和肝素等。当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用，如图7-14a所示。如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合，如图7-14b所示。,图7-14间隔臂的作用,8.3亲和色谱介质,8.3.2亲和吸附剂及其制备方法偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体（基质）1）基质活化：不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。,8.3亲和色谱介质,溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基,2）引入连接臂（spacearm）又称手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B,手臂,作用：减少亲和作用空间位阻连接：通过化学反应与活化基团连接手臂化合物：乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2已二胺NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH环氧氯丙烷1，4-丁二醇缩水甘油醚,8.4.1亲和吸附等温线亲和吸附平衡基本上可以用Langmuir或Freundlich等温式表达。在吸附浓度较低的范围内，吸附等温线近似为线形Freundlich型吸附等温式其中cm的指数值越小，表示亲和结合力越强，当指数值小于0.1时，吸附平衡可以用矩形等温式近似。,8.4亲和吸附平衡,8.4亲和吸附平衡,8.4.2色素亲和吸附平衡色素亲和吸附剂吸附蛋白质的机理较复杂色素配基CB为一种生物模拟色素，具有特殊的化学结构，可以和多种蛋白通过不同机理结合。CB分子的多个芳环使其具有一定疏水性，可以与蛋白质非极性表面发生疏水性相互作用；CB分子的发色基团具有与NAD+和NADP+相类似的构象和尺寸，可以与核苷酸依赖酶发生特异性结合；CB分子带有磺酸基，具有阳离子交换基的乡长，可以和蛋白质发生静电相互作用。色素配基与载体介质有吸附作用，在高盐浓度下，两者间可发生强疏水性作用，造成色素配基倒伏，导致吸附容量下降,8.4亲和吸附平衡,亲和层析包括进料吸附、清洗、洗脱和介质再生几个步骤。吸附操作要保证吸附介质对目标产物有较高的吸附容量，杂质的非特异性吸附要控制在尽可能低的水平。一般杂质的非特异性吸附与其浓度、性质、载体材料、配基固定化的方法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。为了减小吸附操作中的非特异性吸附，所用的缓冲液的离子强度要适当，缓冲液的pH应使配基与目标产物及杂质的静电作用较小。料液流速是影响层析速度和效果的重要因素。提高流速虽可加快分离速度，但会降低柱效。此外，琼脂糖容易受压变形，压力过大反而流速降低。,8.5亲和色谱过程分析,清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和颗粒间空隙中的杂质，一般使用与吸附时相同的缓冲液。目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时，可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否复性。洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱，以备下次使用。,8.5亲和色谱过程分析,1）层析前：制备亲和层析剂选择根据欲分离物质特性配基选择根据配基分子大小及基团特性载体2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱,偶联,亲和层析剂,操作：,非专一性洗脱：改变温度改变pH值改变离子强度专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物）被吸附物质结合竞争性地与配体结合,Affinitychromatography,Competitiveelution,8.5.2模型分析基于线性推动力速率方程和恒定图式假设推算的总传质系数，预测穿透曲线的。利用轴向扩散模型描述亲和色谱操作过程如果亲和吸附平衡关系符合Freundlich等温式假定恒定图式假设成立利用简化的线性推动力速率方差表示固液相间的传质速率,8.5亲和色谱过程分析,F,经过积分和转换得到公式Kfa并非常数，而是浓度的函数，公式中用平均值表示，通过实测穿透曲线，利用公式可以计算Kfa平均值。,8.5亲和色谱过程分析,亲和层析专一性高，操作条件温和，过程简单，纯化的倍数可达几千倍级，能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。亲和层析最初用于蛋白质特别是酶的分离和精制上，后来发展到大规模应用于酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离精制上。在生物化学领域，主要用于各种酶、辅酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分离分析。,8.6亲和色谱的应用,1）纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。,应用,8.6.1t-PA的纯化酶的抑制剂为亲和配基,8.6亲和色谱的应用,8.6.2干扰素的纯化免疫亲和色谱,8.6亲和色谱的应用,8.6.3脱氢酶的纯化色素亲和色谱,8.6亲和色谱的应用,8.6.4淀粉酶抑制剂的纯化固定化金属离子亲和色谱,8.6亲和色谱的应用,8.6.5基因重组融合蛋白的纯化,8.6亲和色谱的应用,8.6.5基因重组融合蛋白的纯化利用融合蛋白生产目标产物使分离纯化过程更简便。但利用融合蛋白表达目标产物也带来新问题：亲和标记物除少数用化学水解法外，多数用蛋白酶水解法裂解除去，酶裂解法虽然选择性较高，但需要在较高温度下进行，容易引起目标蛋白的非特异性水解；裂解后需附加色谱分离步骤除去蛋白酶，使纯化过程复杂化；考虑蛋白酶需在裂解完成后除去，为方便纯化操作，一般蛋白酶用量较小，易裂解不完全；由于大分子蛋白酶不能有效地与融合蛋白部位接触，许多融合蛋白很难在所希望的融合部位裂解,8.6亲和色谱的应用,8.6.5基因重组融合蛋白的纯化针对以上问题，Walker等开发了利用融合蛋白酶裂解目标融合蛋白的方法，解决了裂解用酶的分离问题。利用分子质量小（2*104）、低温下活性高、水解特异性高的蛋白酶3C与不同亲和标识物融合，得到各种标识物的融合蛋白酶3C（记作Tag-3C），可有效裂解其他融合蛋白的融合部位，同时容易用相应亲和吸附色谱回收。,8.6亲和色谱的应用,8.7.1原理和特点亲和膜（affinitymembrane)利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和色谱的变型。所以，利用亲和膜的纯化方法又称亲和膜色谱。,8.7亲和膜色谱,传统固定床型亲和色谱，床层压降随流速线性增大；软凝胶类固定粒子机械强度