《生物化学》课件-生化试验技术

生化实验技术专题,主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。,目录,第一节生物大分子物质的制备第二节几种主要的生物化学实验技术,第三节生物分子的检测,第一节生物大分子物质的制备,一一般过程,二注意事项,三纯化方案的设计和评价例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化,材料的选择、细胞的破碎有效成分的粗分级成分的细分级样品纯度的鉴定浓缩、干燥鉴定,生物大分子分离纯化的一般步骤,层析法电泳法超离心法超滤,盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀透析,前处理粗分级细分级,材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）,生物组织无细胞提取液粗产品,结晶,注意事项,1控制适当的pH2控制低温3注意提取过程中的溶液环境4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基,宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化,纯化步骤总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）,1、粗酶液8043205411002、乙醇沉淀2935851232.27833、醋酸钙沉淀2129801412.64694、盐析417714648.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、结晶0.12130107219.703,第二节几种重要的生物化学实验技术,一、层析技术二、电泳技术三、离心技术,一层析技术（chromatography）,1层析技术一般原理2层析技术分类及应用,层析技术原理,层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。,样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：样品原点到斑点中心的距离Rf=样品原点到溶剂前沿的距离,层析法分类（按装置分类）,纸层析薄膜层析柱层析,氨基酸分析仪图解,层析法分类及原理（按分离原理分类）,吸附层析分配层析凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析亲和层析聚焦层析,各类层析的原理和载体,类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose6B）,吸附层析（absorptionchromatography）,原理：,以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。,载体：硅胶氧化铝羟基磷灰石,应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸等生化物质,分配层析,原理：,分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。,载体：纤维素硅藻土硅胶,应用：各种生化物质的分离鉴定,分子筛层析（gel-filtrationchromatography）,原理,基质葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）,应用测定分子量脱盐和浓缩分离提纯生物大分子除去热原物质,离子交换层析（ion-changechromatography）,原理基质疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用制备纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用,原始缓冲溶液的反离子,样品溶液,梯度浓度,亲和层析（affiuitychromatography）,应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能,原理：,基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex,聚焦层析（Chromatofocusing）,该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。,层析时的聚焦效应示意图,流速,移动速率,几种主要层析方法比较,二、电泳技术,1电泳的一般原理2.电泳技术的类别、原理及应用,电泳的一般原理,电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。,电泳技术分类（按实验装置分类）,纸电泳薄膜电泳凝胶电泳,毛细管电泳,垂直板凝胶电泳,常用电泳技术,1、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）3、SDS-PAGE4、PAGE等电点聚焦3、琼脂糖电泳4、毛细管电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,凝胶聚合反应及催化系统不连续PAGE可产生的三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应,SDS-PAGE,原理：当SDS（SodiumDodecylSulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：LogM=ab应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质亚基数,等电点聚焦（isoelectricfocusing）,原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质分子量,免疫电泳immunoelectrophoresis,微量多槽免疫电泳火箭免疫电泳,毛细管电泳,毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。,毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。,毛细管电泳装置示意图,三、离心技术,1离心机类别普通离心机6000转/分高速离心机2-3万转/分超速离心机3万转/分,2沉降系数（S）概念,3超离心法类别沉降速度法（sedimentationvelocity）沉降平恒法（sedimentationeguilibrium）,超速离心机工作原理图解,沉降系数（S）,生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=110-13秒。,沉降系数（S）与分子量（M）的关系,Svederg方程:,生物分子的检测,1、蛋白质的测定凯氏定氮法（含N量6.25）双缩脲法、Folin-酚法紫外光度法（max=280nm）离心沉降法、电泳法、层析法2、酶活力的测定终点法、动力学法3、氨基酸的测定茚三酮法Sanger法、Edmam法、DNS法4、核酸的测定紫外光度法（max=260nm）分子杂交法离心沉降法、电泳法,核酸操作技术,一、核苷酸序列测定二、Western-blotting、Northern-blotting三、PCR,一、核酸的序列测定,Sanger：双脱氧链终止法和Gilbert：化学法双脱氧链终止法的技术基础：、凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动快，大片段移动慢。、用合适的聚合酶可以合成出与单链DNA互补的链。、反应体系中包括：单链模板、四种脱氧核苷酸、合适的引物、一定比例的2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)以及若干种适量的无机离子。,核酸化学,酶法测定DNA序列的原理,DNA序列测定的自动化,二、核酸印迹,Southern-blotting：Southern印迹。指经过凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相载体上，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。Northern-blotting：通过凝胶电泳使完全变性的RNA按照大小分离，然后通过印迹技术将RNA分子转移到固相支持物上，固定后采用特异探