生物化学实验-氨基移换反应及其产物的鉴定

实验七,氨基移换反应及其产物的鉴定,丁鸣,丁鸣,一.实验目的和要求1.学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；2.学习纸层析的原理和操作技术。,二.实验基本原理1.氨基移换反应：在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的-氨基和-酮酸的-酮基之间发生的互换反应。转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase,GPT）、谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）活性较高。,GPT催化下的转氨基反应：,L谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L谷氨酸氧化脱NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L谷氨酸。本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT)的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。,2.纸层析原理：滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。,丁鸣,溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：,X原点到层析斑点中心距离Y原点到溶剂前沿的距离,在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。,用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。,3.茚三酮的显色原理：氨基酸+茚三酮类紫红色复合物,80,丁鸣,三、实验材料与试剂1.实验材料动物肝脏约3g/2人一组2.实验试剂0.01mol/L磷酸缓冲液(pH8.0):（转氨基反应所需缓冲溶液）；0.1mol/L-丙氨酸(pH8.0):（转氨基反应的底物,纸层析的标准样品）；0.1mol/L-酮戊二酸(pH8.0)（转氨基反应的底物）；0.1mol/L谷氨酸(pH8.0)（纸层析的标准样品）；展层溶剂:（纸层析用）；10三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；0.25%碘乙酸（抑制L-谷氨酸脱氢酶活性）；显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。,四.实验器材与仪器研钵或匀浆器:1套/每组（2人）；试管及试管架:1套/每组（2人）；恒温水浴箱（37、100）；铅笔、尺和圆规（学生自备）；毛细管（直径0.5mm)；新华定性滤纸（直径11cm）；剪刀和镊子:各1把/每组（2人）；电吹风:1把/每组（2人）；滴管；康氏皿（1套/每人）；喷雾器（4-6个/每班）；烘箱（80）1台；一次性手套。吸水纸、两层纱布/人,丁鸣,五.实验操作方法和步骤1.转氨酶液的制备取新鲜动物肝脏约3g/组（2人），将肝剪碎放入研钵或匀浆器中，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨（匀浆），再加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集滤液即得转氨酶提取液备用。2.氨基移换反应取4支洁净、干燥的试管，按表1操作,表1,5.5cm,1cm,用铅笔作出点样位置,用铅笔尖在圆心处截一小孔,3.层析准备：取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约0.2cm)，戴一次性手套操作，以免污染滤纸。另取2cm3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。,2cm,3cm,“灯芯”制作,点样：用毛细管依次点标准-丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)各点2次，其余14号管样液各点23次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。,2,11号管反应样液22号管反应样液33号管反应样液44号管反应样液5标准样液：-丙氨酸6标准样液：谷氨酸,3,2,4,5,1,6,丁鸣,点样,点样处,1,2,3,4,5,6,（可将滤纸放在康氏皿的盖子上操作）,展层、显色将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中,平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯芯上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯芯，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘箱（80）中显色3min。,4,3,2,图1层析装置示意图,1.康氏皿2.展层溶剂3.“灯芯”4.层析滤纸,1,1,2,3,层析滤纸点样后，放入康氏皿并盖上盖子。,展层,流动相不断由“灯芯”向外扩展,1,2,3,展层过程,谷氨酸标准样品,丙氨酸标准样品,丙氨酸,氨基酸样品的分离图谱,溶剂前沿,原点,6,5,1,2,3,4,丁鸣,氨基酸样品的分离图谱,六.结果分析讨论七.思考