细胞生物学教学课件第四章细胞生物学的研究技术

第四章细胞生物学的研究技术,TechniquesinCellBiology,Preparatoryobserve,putforwardtheoretics,Designcontroltests,Collectdata,Explainresults,Deviseconclusion,Refertoknowledge,第一节细胞形态结构的观察,普通光镜,特殊光镜,形态观察,扫描电镜,高压电镜,透射电镜,扫描隧道显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,微分干涉差显微镜,荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,光学显微镜,电子显微镜,扫描探针显微镜,原子力显微镜,一、显微结构的观察,显微结构（microscopicstructure）-通过光学显微镜观察到的细胞结构。（一）普通光学显微镜（二）相差显微镜（三）微分干涉差显微镜（四）暗视野显微镜（五）激光扫描共聚焦显微镜（六）荧光显微镜,普通光学显微镜,最大分辨率0.2m；最大放大倍数1000倍。,H-E染色后的上皮柱状细胞,相差显微镜(phasecontrastmicroscope),倒置相差显微镜,荷兰物理学家F.Zernike于1932年发明：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光程差转变成振幅差，从而提高了活细胞结构的反差，解决了对活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）。,微分干涉差差显微镜(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope),Nomarski于1952年在相差显微镜原理的基础上发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。,暗视野显微镜(darkfieldmicroscope),能见到小至4nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。,荧光显微镜(FluorescenceMicroscope),照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品；光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；,有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外等，用以保护人目。,分裂细胞的免疫荧光图像,抗原(细胞的蛋白质成分),特异性结合,用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描，得到光学切片，并可整合为三维影像。,激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM),二、亚微结构的观察,亚微结构（submicroscpicstructure）-细胞中直径小于0.2um的结构。超微结构（ultramicroscopicstructure）-接近分子水平的结构。（一）电子显微镜（二）扫描探针显微镜,用电子束作光源，用电磁场作透镜，分辨力可达0.2nm。主要用于观察细胞内部结构。由于电子束的穿透力很弱，用于电镜的标本须制成厚度约40-50nm的超薄切片。,透射电镜(transmissionelectronmicroscope，TEM),电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子被收集、转换、放大后显示在荧光屏上。,扫描电镜(scanningelectronmicroscope，SEM),图像为立体形象，反映了标本的表面结构。分辨力约为3nm。,加速电压大于120kV的透射电镜。穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一个完整细胞厚度。可以得到细胞内部的三维精细结构图象，如细胞骨架的立体网络。,高压电镜(highvoltageelectronmicroscope),超薄切片技术负染色技术（染背景不染样品）冰冻蚀刻复型技术扫描电镜样品制备技术,电镜样品的制样技术,冰冻蚀刻复型技术,标本置于-196C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。,蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,复膜,根据量子力学原理中的隧道效应而设计。分辨率很高，横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。,扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope，STM),相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物大分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中直接观察，故其适用范围有明显扩大。不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的可重复性大大提高。,原子力显微镜,第二节细胞的分离与培养,有效获得单一类型的细胞获得较大的细胞群体细胞工程方面的应用,一、细胞的分离,利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。,从细胞悬液中分离某种细胞：流式细胞仪（flowcytometer,FCM）亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activatedcellsorting,FACS),二、细胞的体外培养,一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖，而且可以表现出它在体内的一些分化特性。,1.细胞体外生长条件：培养基：必须氨基酸、维生素、动物血清、糖、盐支持物：塑料、玻璃，或包被包外基质其它条件：pH值、CO2、温度、湿度，无菌环境等,原代培养：由起始实验材料所进行的细胞培养传代培养：对已有的细胞进行的继续培养细胞系：通过原代培养所长出的细胞培养物有限性细胞系：不能传代或只能传少数几代连续性细胞系：能够连续地传很多代永久性细胞系：能够无限地传代细胞株：由单一类型的细胞所组成的细胞系。,一些有关细胞培养的概念,2.体外培养细胞的特性形态特征：上皮形、梭形、多角形、圆形增殖特性：一般细胞能传十代左右，少数细胞可传40-50代极少数细胞变成永久细胞人为分为IIIIII三个时期（增殖期、平殖期、衰退期）功能特性：可以保留活体组织中的某些功能特性，随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。,三、细胞融合,细胞融合（cellfusion）：两个或两个以上的细胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象。人工诱导的方法：生物诱导法、化学诱导法、物理诱导法。异核体（heterokaryon）：两个不同的细胞融合到一起，但其核仍然是分开的。合核体（synkaryon）杂种细胞系（hybridcellline）,第三节细胞组分的分析,一、细胞器和大分子的离心分离,适合于各种细胞器和大分子的分离。原理：利用各种细胞器或组分的大小和相对密度的差异，在同一离心场内的沉降速度不同。过程：匀浆，离心分离，分析,二、蛋白质的层析分离,蛋白质是细胞中重要的组分，种类繁多，生化性质和功能活动复杂。原理：利用分子的大小、极性及亲水性等生化特性将不同类型蛋白质进行分离。分离方法：柱层析（离子交换，疏水分子筛，亲和性）；高压液相层析。,凝胶过滤柱层析,离子交换柱层析,亲合层析,三、蛋白质的电泳分析,电泳分析可以得到蛋白质分子大小，以及是否由多个亚基单位组成等的信息。原理：在一个电场中，蛋白质的迁移率与其大小、形状和电荷的强弱等因素有关。方法：SDS-PAGE,westernblotting,二维凝胶电泳（2-D）。,四、RNA的分离与分析,分离方法：在抑制RNA酶前提下，利用RNA分子通常很小且可溶于水，并能在乙醇中沉淀等生化特征将其分离。分析的目的：了解某一特定细胞或组织中某个或某些基因的mRNA水平。或者比较两种或多种类型或状态细胞中基因活动的差异。分析的方法：PCR，Northern杂交，mRNA的消减杂交及基因芯片等。,五、DNA的分离与分析,基因组DNA分离的方法：使用RNA酶消化掉细胞内存在的各种RNA，利用DNA溶于水，可以被乙醇沉淀的特性将其分离。分离DNA的目的：认识与细胞某一特定生命活动相关基因的结构和功能。前提是要知道所分离基因的核苷酸序列（部分或全部的）。,第四节活细胞内分子的分析,目的：认识一些特殊分子在细胞内存在的量和位置，以及他们在细胞生命活动中的动态变化等方面情况。,一、细胞内分子的示踪,将放射性核素标记的，可参与某种大分子物质合成的前体物质加入到细胞培养液中，经过一定时间的培养，使标记的前体物质进入细胞内，带有放射性的前体物质便可进入大分子中。追踪放射性标记即可探知相关生物大分子的情况。,常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNA的放射自显影图像,二、细胞内离子浓度的测定,探测细胞内离子分子及其浓度的瞬时改变。需要有精密的设备和专门的技术。局部离子浓度测定：膜片钳技术。瞬间快速变化的离子浓度测定：利用离子敏感性指标剂去感受某种离子的存在，并以发光的强弱来反映所测定离子浓度的高低。如，发光蛋白指标剂，荧光钙指标剂。,三、特殊分子向细胞的导入,可阻断特定内源性分子功能活动的分子：如抗体或其他抑制物等。带有标记的可参与细胞结构与功能活动的分子：如荧光标记的微管蛋白方法：显微注射直接扩散膜泡介导法,四、细胞内特异分子的原位鉴定,主要是细胞内的蛋白质分子原理：利用抗体对抗原的特异性识别与结合的特性，实现对目标蛋白质在细胞内存在、分布，以及其与细胞功能活