细胞生物学教学课件第13章 细胞凋亡

第十三章细胞衰老和细胞凋亡,Chapter13cellsenescenceandApoptosis,第一节细胞衰老(cellularaging或cellsenescence),一、细胞衰老和Hayflick界限(HayflickLimitation）,概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞的增殖能力与供体年龄有关物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系,细胞增殖能力逐渐减弱的现象称为细胞衰老。,人胚的成纤维细胞：可持续分裂60-80次；40岁成人的成纤维细胞：可持续分裂40次；80岁老人的成纤维细胞：可持续分裂10-30次。,随个体年龄的增长，体内干细胞的增殖能力不断下降,人细胞的最高分裂次数为60-80次！,成纤维细胞的最高分裂次数与动物寿命有一定的比例关系,人：60-80次100150岁；,鸡：15-35次35年；,小鼠：14-28次23年；,龟：90-125次n100岁；,红杉树(redwood)（美国西部）：4,000多年,银杏树（安徽省徽县、山东省莒县）：3,000多年,植物细胞：,但也有些动物没有最高分裂次数，其细胞永远具有分裂能力，如鱼类和一些无脊椎动物(昆虫例外)。但无论它寿命有多长，但终究会衰老和死亡的。,无最高分裂次数永生!,衰老细胞结构的变化,内质网的变化:衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了线粒体的变化:通常，细胞中线粒体的数量随年龄减少，而其体积则随龄增大致密体的生成,细胞核的变化体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化,质膜系统的变化衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小衰老细胞间间隙连接;细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化,复制衰老的机制复制的次数是确定的-Hayflick界限1970年，的末端复制问题：聚合酶不能从头合成子链，复制母链端时，子链端与之配对的引物被切除后会产生末端缺失，导致子链端随着复制次数的增加而逐渐缩短。俄罗斯科学家认为复制不断缩短的末端可能是正常细胞有限分裂的原因。年，四膜虫的端粒序列与哺乳动物的端粒相似，可以对端粒的长度进行测算。年，研究证实细胞端粒长度随着分裂次数增加确实在不断缩短。年，获得端粒的缩短导致细胞缩短的直接证据。端粒酶的发现及端粒酶基因的导入。,细胞衰老的分子机理,端粒缩短引发细胞衰老的分子机制年发现和失活导致人成纤维细胞永生化。是细胞周期调控因子，促进细胞从期进入期。活化促进活化。突变的不能被磷酸化，阻止细胞周期运行，引发衰老。目前认为所有阻止细胞周期运行的因子如，包括和可以抑制的活性，引发细胞衰老。,胁迫诱导的早熟性衰老许多刺激性因素如过量的氧乙醇离子辐射和丝裂霉素等均能够缩短细胞的寿命，促进细胞衰老，这种细胞衰老称为胁迫诱导的早熟性衰老（SIPS）。研究发现SIPS和RS的机制类似。均涉及p53-p21以及p16信号途径。,氧化性损伤学说：衰老现象是由生命活动中代谢产生的活性氧成分造成的损伤积累引起的。支持证据:清除自由基可以延长寿命。（果蝇）分子age1基因并不与SOD基因相同。小鼠SOD基因剔除并未加速衰老。,单细胞生物的衰老芽殖酵母的衰老由rDNA的变化决定。串联重复的rDNA（8号染色体，100-200拷贝），经同源重组形成rDNA环，游离于染色体外，不进入子细胞，仍积累于母细胞，随着细胞分裂次数不断增加，rDNA环增加。当积累到500-1000拷贝时，细胞衰老。,体内健康细胞在特定的细胞外信号的诱导下，其死亡途径被激活，于是在有关基因的调控下发生死亡，细胞的这种死亡方式称为程序化细胞死亡(programmedcelldeath)，又称细胞凋亡(apoptosis)。,第二节细胞凋亡,一、细胞凋亡的概念及生物学意义,细胞凋亡在性质上与细胞坏死的对比图解,细胞坏死时，质膜破裂，细胞质溢出；,细胞凋亡，细胞质凝缩，但质膜仍保持完整,程序性细胞死亡与细胞坏死的区别,对动物个体的正常发育，自稳态的维持，免疫耐受的形成，肿瘤监控等多种生理和病理过程具有重要意义.,细胞调亡的生物学意义：,发育过程中手和足的成形过程,脊椎动物的神经系统的发育,一种生理保护机制，清除体内多余、受损或危险的细胞而不对周围的细胞或组织产生危害。在成熟的动物个体中，通过细胞凋亡和细胞增殖速率的调节来维持组织器官细胞数量的稳定。,1、凋亡细胞的形态变化：,二、细胞凋亡的主要特征,细胞质凝缩细胞萎缩细胞骨架解体核纤层分解核被膜破裂,细胞核逐渐皱缩至最终解体的过程,2、凋亡细胞的生化特征,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0h2细胞色素c诱导1h3细胞色素c诱导2h4细胞色素c诱导3h5细胞色素c诱导4h6阴性对照7Marker,凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG（tissueTransglutaminase）积累并达到较高水平,DNA出现断片化,3、形成凋亡小体(apoptoticbodies),表面糖基发生改变,磷脂酰丝氨酸反转至外脂层,一些膜围小泡,巨噬细胞表面的凝集素识别,巨噬细胞对暴露的磷脂酰丝氨酸具有识别能力,凋亡细胞质膜性质发生改变,凋亡细胞,凋亡小体被邻近细胞吞噬而被清除的过程图解,凋亡小体,a正常T细胞杂交瘤细胞b凋亡细胞(扫描电镜)c凋亡细胞(透射电镜),四细胞凋亡的检测,形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（cometassay）流式细胞分析根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。,三诱导细胞凋亡的因子,物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等,一切冬酶的性质和作用切冬酶(caspases)：在蛋白质水解酶级联途径中具有专一性切割蛋白质分子中的Asp-X肽键活性的半胱氨酸蛋白酶系。全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白质水解酶。又被称为胱冬肽酶,第三节细胞的凋亡机制,Caspase的研究首先是在秀丽隐干线虫细胞的凋亡开始的，从胚胎发育至成体，线虫共产生了1090个体细胞，其中131个体细胞凋亡。研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。2002年美国麻省理工学院的Roberthorvitz,英国的SydneyBrenner和JohnE.Sulston因在线虫细胞凋亡方面的创新性研究共同获得诺贝尔医学和生理学奖。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1，催化白介素-1前体的剪切成熟过程。在大鼠上成纤维细胞过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡。,线虫中ced-3、ced-4和ced-9的产物直接参与细胞凋亡的过程图解,ced-9通常与ced-3和ced-4结合成复合物，故ced-3无活性。细胞凋亡信号引起ced-9与ced-3和ced-4解离，ced-3得以被激活，细胞进入凋亡途径。ced-4能与ced-3结合并使之激活，而ced-9可与ced-4结合，使ced-4不能激活ced-3。,切冬酶家族成员的特征及其功能,切冬酶家族成员的特征：,细胞凋亡的过程：激活期和执行期两个阶段。前期细胞应答死亡信号，起始Caspase活化；后期执行Caspase活化，执行细胞死亡程序。,最初翻译产物为无活性酶原，在Asp-X键处被切割成亚基后才组装成四聚体活性酶(2大亚基和2小亚基)；均有相同的催化部位(含有QACXG保守结构域)；具有自身活化和活化其它切冬酶的能力。Caspase-8和10含有串联重复的死亡效应结构域（），和含有Caspase募集结构域（）。,执行Caspase的活化属于异性活化，即起始Caspase招募执行Caspase原酶分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行Caspase切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞凋亡。,DFF45,DNAfragmentationfactor-45ICAD,inhibitorofcaspase-activatedDNase,lamin,GelsolinFAKPAK2,核酸调节蛋白,与相邻细胞脱离接触；细胞骨架重新装配；DNA复制和修复过程被关闭；mRNA无法剪接；DNA受破坏；核结构紊乱。,切冬酶小结,切冬酶,Caspase依赖性的细胞凋亡：包括死亡受体起始的外源途径和线粒体起始的内源途径死亡受体介导的凋亡：死亡配体与受体结合：死亡配体主要是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员，TNF由激活的单核-巨噬细胞分泌，诱导细胞凋亡和诱发炎症反应。死亡受体TNF-R1和Fas（Apo-1，CD95），胞质部分含有死亡结构域（DD），负责招募凋亡信号通路中的信号分子。,细胞凋亡的内源途径：线粒体是核心当细胞受到内部或外部凋亡信号的刺激，胞内线粒体的外膜通透性改变，向细胞质基质释放凋亡的相关因子，引发细胞凋亡。细胞色素c的释放是细胞凋亡内源途径的关键，线粒体外膜的通透性主要受到Bcl-2蛋白家族的调控。Bcl-2蛋白家族是线虫抗凋亡蛋白Ced9的同源物。其功能可以分为两组，Bcl-2、Bcl-xL,Bcl-w等抑制细胞凋亡，Bax、Bak和Noxa等促进凋亡。,BCL-2家族成员,大部分一般作为线粒体膜的整合膜蛋白被隔离起来,以非活性的形式定位分布于细胞质溶质中,Caspase非依赖性的细胞凋亡Caspase非依赖性的细胞凋亡确实存在，但机制仍不完全清楚。凋亡诱导因子（AIF）位于线粒体外膜，可以转移到细胞质，并进入细胞核，引发核内DNA凝集并断裂形成50kb大小的片段。限制性内切核酸酶G（EndoG)可以诱发Caspase非依