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文档简介

蔗糖酶的提取,实验一,细胞破碎的常用方法,机械法,非机械法,液体剪切法,固体剪切法,超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法,压力和研磨,物理法、化学渗透法、酶溶,一、实验目的和要求学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。二、实验基本原理1、酵母细胞破碎,本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。,2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。,三、实验材料与试剂1、实验材料市售干酵母粉10g/组(34人）2、实验试剂石英砂，95%乙醇(-20），20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液。四、实验器材与仪器1、电子天平（称量样品）；2、研砵（每组一套）；3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；4、托盘天平（离心管平衡用）；5、高速冷冻离心机；6、恒温水浴箱（50）；7、制冰机；8、1.5ml离心管（留样品、用）及离心管架；9、7ml离心管（留样品用）及离心管架；10、20冰箱。,五、实验操作方法和步骤分组操作：每组34人。1、酵母细胞破碎称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml的20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4、12000r/min离心15分钟，收集上清液（样品I）并量出体积V1,另留1ml上清液（标注样品I）放置20冰箱保存，用于后续实验。2、热处理：将上一步离心得到的上清液（样品I），转移至两支50ml离心管中，放入50恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液。结束后迅速用冰浴冷却5分钟，平衡后，4，12000r/min离心15分钟，收集上清液（样品）并量出体积V2，另留1ml上清液（标注样品）放置20冰箱保存，用于后续实验。,3、有机溶剂（乙醇）沉淀：将热处理后的上清液放入冰浴中，缓慢地加入相同体积的-20的95%乙醇，加入的过程在冰浴上进行，并始终保持温和搅动混匀，整个过程约持续20-25分钟。完成后将溶液转移至两支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置20冰箱保存，以备用于下周实验实验二离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。六、实验结果分析讨论七、思考题本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗
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