《生物化学》课件-分子生物学研究方法VIP

第八章分子生物学基本研究方法,（BasicTechniquesinMolecularBiology）,引言,基因操作也称重组DNA技术，主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主细胞内，进行持续稳定的繁殖和表达。,从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。,本章的主要内容,第一节重组DNA技术回顾第二节DNA的基本操作技术第三节RNA的基本操作技术第四节基因克隆技术第五节基因芯片技术第六节蛋白质组学及其研究技术,第一节重组DNA技术回顾,(ReviewofRecombinantDNATechnique),第八章分子生物学基本研究方法,一、什么是重组DNA技术？,重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）,又称为基因克隆（GeneCloning）或分子克隆（MolecularCloning）技术。是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。,重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。,二、重组DNA技术的基本步骤,目的DNA的获得与载体的制备；目的DNA与载体的连接；重组DNA导入受体细胞；重组DNA的筛选和鉴定；目的DNA的表达及表达产物的检测与分离纯化。,三、重组DNA技术的四大要素,目的DNA载体（Vector）工具酶宿主细胞,（一）目的基因（外源基因）的获取,获得需要的目的基因常用的方法：,1、分离的基因DNA片段或基因；,2、mRNA逆转录合成的cDNA；,3、化学合成人工目的基因；,4、PCR体外扩增的DNA片段。,（二）载体,载体（Vector）：是指能运载外源性DNA进入宿主细胞，并能进行自我复制的DNA。,克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。,表达载体(expressionvector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。,（1）按功能分类：,整合载体（integratedvector）:为把一个基因插入到染色体中而特意设计的载体。,1、载体分类,（2）进入受体细胞类型分类：,穿梭载体（Shuttlevector）：是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。,原核载体,真核载体,（3）按载体来源分类：,噬菌体载体（入噬菌体、M13噬菌体）,质粒载体,柯斯质粒（Cosmid）,细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosome，BAC）,P1源的细菌人工染色体（P1-derivedArtificialChromosome，PAC）,酵母人工染色体（YeastArtificialChromosomeYAC）,病毒载体,哺乳动物人工染色体（MammalArtificialChromosome，MAC）,人类人工染色体（HumanArtificialChromosome，HAC）,植物人工染色体（PlantArtificialChromosome，PAC）,常见载体的种类和特征,2、载体应当具备的条件,（1）能自主复制。容易获得大量的重组的DNA分子；（2）具有合适的外源DNA插入的位点（克隆位点或限制性内切酶的切点）。便于接纳不同的DNA片段。（3）具备可供选择的遗传标记。便于进行重组体筛选和鉴定。（4）载体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的DNA部分，这样可以容纳较大的外源DNA。（5）在宿主细胞内的稳定性高。,多克隆位点,Ori,复制起始点,遗传标记,Amp,MCS,载体,（三）工具酶,重组DNA实验中常见的主要工具酶,我们的基本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：,1、准确切割DNA分子的工具（“分子手术刀”）-限制性内切酶,2、DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）-DNA连接酶,1、限制性核酸内切酶-“分子手术刀”,限制性核酸内切酶（RestrictionEndonuclease,RE）：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。,分类:I、II、III（重组DNA技术中常用II型）,命名原则:,Hind,Haemophilusinfluenzaed菌株流感嗜血杆菌d菌株的第3种酶,第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小写；上述字母都是用斜体。接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写；如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序分别用罗马数字、表示。,识别序列特点回文结构(palindrome)即反向重复结构，以DNA分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。,每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特异序列，称为限制性位点或切点（48bp）。,识别序列：,BamH,+,SamI,+,平末端（Bluntend）：对称轴切割,粘性末端（Stickyend）：交错切割,切口：平端切口、粘端切口,几个常用限制性内切酶及其切点,如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。,2、DNA连接酶-“分子缝合针”,DNA连接酶（DNALigase）：催化两条DNA链的3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4DNA连接酶。,外源基因与载体的连接方式：,（1）粘性末端连接,方式：同一限制性内切酶切点的连接不同限制性内切酶切点的连接,（2）平端连接,适用于：限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端,（3）同聚物加尾连接,由末端转移酶（Terminaltransferase）作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。,（4）人工接头,平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。,（四）宿主细胞,大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞,1、常用种类,2、导入方式,转化（transformation）转染（transfection）转导（transduction）,第二节DNA的基本操作技术,（TechniquesforDNAManipulation）,第八章分子生物学基本研究方法,一、核酸的凝胶电泳,二、细菌转化与目标DNA分子的增殖,三、聚合酶链式反应,四、实时定量PCR,五、基因组DNA文库的构建,一、核酸的凝胶电泳,核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进行分离。因此，可用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术基础。,基本原理,生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈负离子化状态。同时，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同大小的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。,一种带电荷的分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。这种分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率与分子的摩擦系数成反比，而摩擦系数是分子大小、极性、介质粘度等的函数。因此，在同一凝胶中、一定电场强度下，可根据分子大小的不同、构型的差异以及所带电荷的多寡，将分子混合物中的各种成分彼此分开。,常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来的。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经化学修饰后，琼脂糖的熔点会降低（低熔点琼脂糖），在较低温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。,聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。催化聚合的常用方法为化学聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1,000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力,凝胶的EB染色,溴化乙锭（EthidiumBromide，EtBr）是一种扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在特定波长的紫外线照射下发出荧光。由于此种染料不能与琼脂糖或聚丙烯酰胺结合，因此，只有DNA分子能够吸收溴化乙锭并发出荧光。,溴化乙锭染料对DNA分子的插入作用,在凝胶电泳中或后，加入溴化乙锭（Ethidiumbromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。,脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-FieldGelElectrophoresis，PFGE）,实验表明，超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（50kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。,PFGE解决了这一问题。在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。由于电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA分子需要随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。,脉冲电场电泳示意图,二、细菌转化与目标DNA分子的增殖,细菌转化（Transformation）:,一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。,绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这种处理的细胞被称为感受态细胞（CompetentCell）。,常用细菌转化的方法1-CaCl2法,将快速生长中的大肠杆菌置于经(0）预处理的低渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源DNA粘附在细胞表面。,42下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培养基中分离转化子。,常用细菌转化的方法2-电转化法,利用锐利的电脉冲在细胞膜上造成小凹陷，进而形成纳米级疏水孔洞。随着跨膜电压增加，一些较大的疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，溶液中的DNA很容易通过孔洞进入细胞质。,克隆的筛选和鉴定：,1、抗生素,常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。,2、-互补蓝白斑筛选法,实验室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,载体上：-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列，在编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）；-片段,宿主细胞：编码-半乳糖苷酶C端序列-片段,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。,（LacZ基因N端序列）,LacZ基因N端序列,LacZ酶,细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程,重组体DNA分子的体外包装法,利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入到寄主细胞中这一特点而发明。经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受位点将DNA注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。,噬菌体作为克隆载体的克隆过程,三、聚合酶链式反应,KaryB.Mullis(1944-),聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）:,是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。,20世纪80年代，KaryB.Mullis发明该技术。1993获得NobelPrize。,PCR基本原理,将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子；降低温度，使短链引物分子与该模板DNA两端的特定序列相结合，产生双链区；DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。,反应材料,模板DNA,引物对按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；,DNA聚合酶：耐高温TaqDNApolymerase、PfuDNApolymerase,dNTP,缓冲液溶液Mg2+,Tris缓冲液溶液等,PCR反应步骤,DNA解链（变性）引物与模板DNA相结合（退火）DNA合成（延伸）重复以上三个步骤经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。,PCR仪,PCR仪,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4小时,四、实时定量PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。,实时定量PCR（RealtimequantitativePCR）,Theoretical,LogTargetDNA,Cycle,PCR产物积累规律,PCR扩增中的“平台效应”，导致常规PCR技术对最终产物总量定量的不可靠性。,实时定量PCR的基本原理,在反应体系和反应条件完全一致的情况下，PCR扩增呈指数增长时，模板量与扩增产物的量成正比。由于反应体系中的荧光基团与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。,RealtimePCR常用方法,1、非特异性荧光染料掺入法,常用染料：SYBRGreenI,基本原理：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而自由的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,l,优点：通用性好，只需要设计PCR引物。方法简便，省时，价格低廉。缺点：由于荧光染料和模板的结合是非特异性的，可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，不能有效区分目的双链DNA和非目的DNA分子，所以有时不能真实反映目的基因的扩增情况。,方法的优缺点：,2、特异性荧光探针法,特异性的荧光探针法是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测。,TaqMan荧光探针：,TaqMan探针是一段与模板DNA部分序列完全互补的寡核苷酸，其5端标记报告荧光基团（R），3端标记淬灭荧光基团（Q）；,探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,l,dNTPs,Primers,加样,变性,反应管,l,延伸,1、链的合成起始,2、切割和链置换,3、链合成结束,4、检测,l,退火,五、基因组DNA文库的构建,基因组DNA文库（GenomicDNAlibrary）:,是指将某种生物的基因组DNA用限制性内切酶或机械切割法切成适当长度的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞，形成克隆。汇集某种生物全部遗传信息（基因组DNA中所有序列信息）的重组DNA分子的克隆总和，就称为该生物基因组DNA文库。可用于保存某种生物的全部基因、分离特定的基因片段和全基因组序列测定、分析等。,构建基因组DNA文库需考虑的问题-代表性和随机性,代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。在文库的构建过程中采用了两个策略提高文库的代表性：,一、采用部分酶切或机械随机切割的方法来消化DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；,二、提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。,为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：,N=ln（1-p）/ln（1-f）,N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数,p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率,f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值,人的基因组为3109bp，p=0.99，插入片段平均大小为1.7104bp，则f=1.7104/3109；N=8.1105即要有8.1105个重组克隆才能包括99%的基因组,例如：,基因组DNA文库的类型,根据所选用的载体可以分为：,噬菌体文库,质粒文库,柯斯（COS）质粒文库,细菌人工染色体（BAC）文库,P1源人工染色体（PAC）文库,酵母人工染色体（YAC）文库,基因组DNA文库的构建流程,基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：载体的制备；高纯度大分子量基因组DNA（HighMolecularWeightDNA，HMWDNA）的提取；HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；重组克隆的挑取和保存。,第三节RNA基本操作技术,第八章分子生物学基本研究方法,（TechniquesforRNAManipulation）,一、总RNA的提取,二、mRNA的纯化,三、cDNA的合成,四、cDNA文库的构建,五、文库的筛选,引言,RNA存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，为了研究RNA所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（ComplementaryDNA，cDNA)，再插入到可以自我复制的载体中。由于cDNA来自RNA，几乎不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。,一、总RNA的提取,细胞中的总RNA包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)以及一些非编码的小RNA。一个典型的动物细胞约含有10-5gRNA，其中rRNA占80%85%，tRNA和非编码小RNA占15%20%，mRNA占1%5%。,按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。,常用的RNA提取方法,1、常用提取方法的种类,由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。,2、注意事项,纯的RNA样品其OD260OD280应介于1.8-2.0之间。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；OD260值=1，相当于单链DNA或RNA为40g/mL，寡核苷酸为20g/mL。,RNA的纯度、浓度与完整性,1、RNA的纯度,2、RNA的浓度,rRNA大小完整，而且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。,3、RNA的完整性,二、mRNA的纯化,绝大多数真核生物细胞mRNA的3端存在聚腺苷酸组成的Poly（A+）尾，这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志。,寡聚（dT）-纤维素柱层析法,免疫磁珠法,mRNA的纯化方法,寡聚（dT）-纤维素柱层析法利用mRNA3端含有Po