DNA琼脂糖凝胶电泳分析

1,.,质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳,主讲人：文琪同组人员：黄梦秋张如骐肖重科,实验目的,掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。,实验原理,DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。在pH值为8.08.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,实验器材和试剂,实验器材：桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪样品：DNA分子量标准品，质粒试剂琼脂糖1电泳缓冲液（TBE）6上样缓冲液溴化乙锭(EB)：10mg/ml,上样缓冲液,0.25溴酚兰；0.25二甲苯青；30甘油水溶液作用：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加样操作更方便,琼脂糖凝胶,天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。,琼脂,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。,电泳指示剂：,核酸电泳常用的指示剂有两种溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）；二甲苯青（xylenecyanol,Xc），它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢,核酸电泳的染色剂,最常用的染色剂溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015minEB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出。（注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。）银染色,影响琼脂糖凝胶电泳的因素,DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比；琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大,琼脂糖凝胶的优点,(1)操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,缺点：1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。,银染色银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收,实验操作,制备琼脂凝胶胶板的制备加样电泳紫外透射仪检测,操作步骤,1.准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子,2.配制1%琼脂糖凝胶及倒胶,具体步骤：三角瓶内：0.6g琼脂糖+60ml(0.5TBE)煮胶溶解冷却至60(不烫手)加EB倒板室温下充分凝固垂直向上拔出梳子将胶板放入电泳槽向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面12nm。,3.加样,将DNA样品（5ul）与6上样缓冲液（1ul）混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。,4.电泳,接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳,5.结果观察,电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。,注意事项,1、倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太