第二章DNA重组克隆的单元操作--酶.ppt

第二节工具酶,切,接,转,检,增,完整的基因克隆过程,（一）基本知识,一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease,RE）,1、定义：指一类能够识别双链DNA分子中的某特种特定核苷酸序列（48bp），并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。,2、来源:原核生物,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,限制性核酸内切酶,RE将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）,3.性质:内切酶,在核酸分子链的内部制造切口的酶。,内切酶,限制性核酸内切酶,4.功能:自我保护作用,限制性核酸内切酶,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,I型限制性内切酶,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。,（二）限制性内切酶的类型,II类限制性内切酶,III类限制性内切酶,首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。,（1）酶结构,1.I型限制性内切酶,如EcoB和EcoK。,三亚基双功能酶：R:限制酶亚基M:甲基化酶亚基S:识别DNA序列亚基,（2）识别位点序列,EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC,1.I型限制性内切酶,未甲基化修饰的特异序列。,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,（4）作用机理,在距离特异性识别位点约10001500bp处随机切开一条单链。,Recognizesite,cut,1-1.5kb,（3）切割位点,类型：大型的多亚基的蛋白质。具有内切酶的活性、具有甲基活性化酶的活性。具限制和修饰两种体系，切割位点基本上是随机。因此型内切酶在DNA重组研究工作中并没有什实际用处。,首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,（1）酶结构,相反方向结合的同源二聚体内切酶与甲基化酶分开,2.II类限制性内切酶,分离的第一个酶是Hind,（2）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文对称序列-旋转对称序列，反向重复序列）。与DNA的来源无关。,2.II类限制性内切酶,EcoRI：5-GAATTC-33-CTTAAG-5,（3）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：,识别位点处。,（4）粘性末端,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：,5端凸出（如EcoRI切点）,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCAG,3端凸出（如PstI切点）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCAG,GACGTC,连接便利,粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。,补平成平齐末端,凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。,5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,识别位点和切点完全相同称同裂酶。,同裂酶（Isoschizomers)：,如Hind和HsuI,Hind5-AAGCTT-33-TTCGAA-5HsuI5-AAGCTT-33-TTCGAA-5,（5）II型限制性核酸内切酶的切割方式,如XmaI和SmaI,同位酶：识别位点相同，但切点不同。,（5）II型限制性核酸内切酶的切割方式,同尾酶(Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamHI、Bgl、BclI、Xho等,5-GGATCC-33-CCTAGG-5,BamHI,BclI,5-TGATCA-33-ACTAGT-5,5-AGATCT-33-TCTAGA-5,Bgl,5-UGATCY-33-YCTAGU-5,Xho,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,（5）II型限制性核酸内切酶的切割方式,5-GATC-33-CTAG-5,Sau3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,5-G3-CCTAG,GATCT-3A-5,BamHI,Bgl,5-GGATCT-33-CCTAGA-5,BamHI,Bgl,Sau3A,（6）II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50mMpH7.5,MgCl2,10mM,NaCl,0-150mM,DTT,1mM,0-50mM低盐酶,100mM中盐酶,150mM高盐酶,Volume,20-100ml,TT,371-1.5hr,1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量,II型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,0.1倍体积的5MNaAcpH5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,3.III类限制性内切酶,二亚基双功能酶，也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸），这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,在基因工程操作中用途不大。,EcoP1:AGACC,EcoP15:CAGCAG,异源三聚体,ATPMg2+SAM,TGAN8TGCT,距识别序列1kb处,AACN6GTGC,随机性切割,限制性核酸内切酶的类型,主要特性I型II型III型,限制修饰,蛋白结构,辅助因子,识别序列,切割位点,多功能,同源二聚体,Mg2+,旋转对称序列,单功能,识别序列内或附近,特异性切割,双功能,异源二聚体,ATPMg2+SAM,AGACCCAGCAG,距识别序列下游,24-26bp处,1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,（三）限制性内切酶的命名,用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。,4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。,2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。,3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。,限制性核酸内切酶的命名,属名种名株名,HindIIIHindIII,Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1.DNA的纯度,（四）影响限制性内切酶活性的因素,纯化DNA加大酶的用量1mgDNA用10U酶延长反应时间扩大反应体积（20l）,一般采取,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,2.DNA的甲基化程度,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等。,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。,3.温度,是影响限制酶活性的重要因素。,4.缓冲液(Buffer),缓冲液的化学组成,MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。如高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，能切割与识别序列相似的序列。,所以一般使用专一的反应缓冲液。,星号（*）活性,4.缓冲液(Buffer),EcoRI和BamHI等都有*活性。,在低盐、高pH（8）时可识别和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,GAATTC,EcoRI：,使用的时候要特别注意！,EcoRI在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5AATT3或者5PuPuATPyPy3。,使用的时候要特别注意！,（五）限制性内切酶对DNA的消化,1.内切酶与识别序列的结合模式,1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。,GAATTC,CTTAAG,内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。,2.完全消化,1,2,3,4,1,2,3,4,只有有限数量的酶切位点被切开。,通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,3.局部消化,1,2,3,4,1,4,大多数酶可用65oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。,4.限制酶酶切反应的终止,5.几种常用限制酶识位点,（一）功能：,保护宿主DNA不被相应的限制酶切割。,二、甲基化酶,在大肠杆菌中大多数都有如下位点特异的甲基化酶。,（二）甲基化酶的种类,Dam甲基化酶GATC，A-N6甲基腺嘌呤BamH:GGATCCDcm甲基化酶CCAGG，CCTGG,C-5甲基胞嘧啶EcoR：CCAGG,（三）甲基化对限制酶切的影响,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,如果限制性内切酶的识别位点是从表达Dam或Dcm甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。,修饰酶切位点,三、DNA连接酶(DNAligase),1、定义催化双链DNA片段靠在一起的3-OH末端和5-P末端形成3,5-磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。,53,35,DNAligase,DNAligase连接缺刻(nick),2、种类,（1）大肠杆菌连接酶,只能连接粘性末端。,（2）T4噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。,依据来源可分为两类:,1)修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。,3、DNA连接酶的基本性质,2)修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,3)连接多个平头双链DNA分子：,T4-DNA连接酶,Tris-HCl,50-100mMpH7.5,MgCl2,10mM,ATP,0.5-1mM,DTT,5mM,Volume,10-20ml,TT,4-154-16hr,4、DNA连接酶的反应条件,1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15反应1小时，完全连接1mg-DNA（HindIII片段）所需的酶量。,（1）必须是两条双链DNA。不能催化两单链DNA分子连接；只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺(gap)。,连接条件,DNAligase的活性,（2）DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+,连接条件,连接酶反应的最佳温度是37C。,连接反应的温度,最佳温度,在37下粘性末端的结合很不稳定。,实用温度,所以一般采用416C。,4、平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。,提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM,（一）基因工程中常用的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T4噬菌体DNA聚合酶4.T7噬菌体DNA聚合酶5.耐热DNA聚合酶6.反转录酶7.末端转移酶,四、DNA聚合酶,1.共同特点,把dNTPs连续地加到引物的3OH端。,2.主要区别,T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。,其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。,（二）常用的DNA聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途,1.大肠杆菌DNA聚合酶I,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质,一条单链多肽。,53外切酶活性位于N端。,用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。,53DNA聚合酶活性。,53外切酶活性35外切酶活性,底物：,dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）,Mg2+,带有3-OH游离端的引物,DNA模板,（2）DNA聚合酶I（PolI）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,标记,核酸探针（probe）,能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。,（3）用DNA聚合酶I制备探针,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,标记,已知序列的核酸片断,探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,DNA聚合酶I对探针序列的标记,切口转移法(nicktranslation)：,放射性同位素标记：,DNA聚合酶I同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。,53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。,切口,切口,5,5,3,3,5,3,5,3,纯化的DNA片段,DNaseI制造单链切口,DNAPolI进行切口转移,一种-32P-dNTPdNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,32P-dNTP,32P-dNTP,从头至尾都被标记,2.Klenowfragment,具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。,（1）Klenowfragment的性质,DNAPolIKlenowfragment(76KD）,枯草杆菌蛋白酶,3端补平,5,5,klenow,DNA3末端标记,补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。,在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。,klenow,（2）主要用途,3隐蔽末端的DNA片段,Klenowfragment补平,根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G33-CTTAA5,5-GAA33-CTTAA5,5-GAATT33-CTTAA5,5-G33-CCTAG5,5-GG33-CCTAG5,5-GGATC33-CCTAG5,EcoRI,BamHI,-32P-dATP,-32P-dGTP,25oC1h,cDNA第二链的合成,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,（1）T4DNA聚合酶的性质,3.T4DNA聚合酶,从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。,有53聚合酶活性和35外切酶活性（约为Klenow片段活性的200倍）。,来源,酶活性,特点,当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。,如果只有一种dNTP，则外切至该dNTP互补核苷酸暴露时停止。在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4DNA聚合酶,无dNTPs,T4DNA聚合酶,有dNTPs,5,5,（2）T4DNA聚合酶的用途,标记末端（取代合成法）,用35外切酶活性作用于所有末端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。,补平3隐蔽末端,DNA3末端标记,酶切中间产生两个末端标记,加入某种32P-dNTP和dNTPs,T4DNA聚合酶（35外切）,DNA酶切片段,T4DNA聚合酶（53聚合）,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶切,无dNTPs,4.T7DNA聚合酶,（1）来源,从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：,T7基因5编码的大亚基：,有53聚合酶和35外切酶活性。,大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。,（2）T7DNA聚合酶的特点,持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。,35外切酶活性高,单链和双链都能降解。约为Klenow片段活性的1000倍。,不受DNA二级结构的影响,其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍,进行末端标记,以大分子量DNA为模板的合成,如M13,补平隐蔽末端,（3）T7DNA聚合酶的用途,取代合成法标记3末端。,与T4DNA聚合酶相同。,合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。,5.耐热DNA聚合酶,指在高温下具有活性的DNA聚合酶，主要用于PCR反应。,6.逆转录酶,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）,依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。,（1）来源,RNA肿瘤病毒。,（2）禽源反转录酶的性质,由和两条多肽链组成。,链,有反转录活性和RNaseH活性。,RNaseH：以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。,RNaseH,RNADNA,RNADNA,链,RNA-DNA杂交双链中53DNA外切酶活性。,（3）逆转录酶的用途,合成cDNA,以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA5,cDNA,合成DNA探针,用随机引物（randomprimer）或oligodT做引物。,随机引物：,随机顺序形成的寡聚DNA片断。,（理论上它能与各种序列的模板结合）,RT-PCR用的模板,克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。,7.末端转移酶,来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。可在cDNA或载体的3末端加同聚物尾巴，便于克隆。,末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5p,3HO,OH3,p5,TdT,Mg2+dATP,5p,3HO,AAAAAAAAAAAAOH3,p5,TdT的基本特性：,5p,3HO,OH3,p5,TdT,Co2+dATP,5p,3HOAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAOH3,p5,5p,3HO,OH3,p5,TdT,Co2+dATP,5p,3HO,AAAAAAAAAAAAAAOH3,p5,AAAAAAAAAAA,五、T4多核苷酸激酶,1.来源,T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。,多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。,2.功能,催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。,不论5-OH端突出与否。,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,ATP,T4多核苷酸激酶,如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。,但天然的DNA的5端都是磷酸化的。,3.多核苷酸激酶的用途,DNA5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(-32P)ATP,多核苷酸激酶,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性磷酸酶,（1）正向反应（forwardreaction）,（2）交换反应标记法,反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5端的磷酸交换。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(-32P)ATP、ADP,多核苷酸激酶,反应效果不理想。,六、碱性磷酸酶,1.碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离出来。,Bacterialalkalinephosphatase，BAP,（1）细菌性碱性磷酸酶,（2）小牛肠碱性磷酸酶,Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP,从小牛肠中纯化出来。,具有抗热性。,SDS中加热68oC可完全失活。,2.碱性磷酸酶的特性,催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,碱性磷酸酶,3.碱性磷酸酶的功能,（1）防止线性化的载体分子自我连接,单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。,AAGCTTTTCGAA,Hind酶切,A-OHTTCGA-P,P-AGCTTHO-A,碱性磷酸酶,5,5,5,A-OHTTCGA-OH,HO-AGCTTHO-A,OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。,但同一酶切后的外源DNA的5端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。,ATTCGA,AGCTTA,AGCTT,A,A,TTCGA,连接酶,-OH与-OH连不住,其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。,3,P-AGCTT,A-OH,5,3,HO-A,TTCGA-P,5,外源DNA,七、核酸酶,1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,能够从5-末端或3-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶。它只切割末端有单链突出的DNA分子。,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）,ExoIII,3,5,3,5,Mg2+,3,5,3,5,大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3端外切,3、单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）,Zn2+必需,最适pH范围为4.0-4.3,需要NaCl10-300mM,降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,5G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-