蛋白质分离纯化ppt课件

.蛋白质的分离纯化，蛋白质的分离纯化，(1)材料1，选材2，破碎3，混合物的分离(2)粗分级(3)细分级(4)结晶，样品的预处理，1，生物样品的选择和处理样品的选择：有效成分含量高，来源丰富，实验条件一定，采访技术简单，具有综合的利用价值处理：包括去脂、结缔组织等。 2、细胞破碎：机械破碎法、物理学法、化学法、酶学法3、提取(extraction ) :在一定条件下，以适当的溶剂和方法将有效成分充分溶解于溶剂中的过程。 蛋白质的分离方法、 基于蛋白质溶解度差异的分离沉淀技术基于蛋白质分子尺寸差异的分离蛋白质电荷差异的分离蛋白质和基于某物质吸附差异的吸附分离生物分子特异性的特性亲和色谱蛋白质溶解度差异的分离沉淀技术可逆沉淀：等电点沉淀、盐析法、 有机溶剂沉淀不可逆沉淀：热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀、1、由溶解度的差异引起的(1)盐析法(saltingout)1)定义：在稀薄盐溶液中，蛋白质的溶解度随着盐浓度的增加而上升的现象称为盐溶(saltingin )，盐浓度增加到一定量时溶解度逐渐降低，达到某种浓度2 )原理Saltingin :吸附有蛋白质的离子蛋白质彼此排斥，蛋白质与水的相互作用增强溶解度提高。 Saltingout :加入大量中性盐破坏蛋白质分子表面的水活性膜，降低水的活性度，蛋白质表面的电荷中和蛋白质凝集析出。 3 )盐析中最常用的盐，最好是(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，特别是(NH4)2SO4。 原因： (NH4)2SO4溶解度大，温度系数小，分离效果好，保持蛋白质自然结构，廉价获得，是蛋白质粗精制的最常用方法。(2)等电点沉淀法1)pH偏离pI时，蛋白质带有相同符号的净电荷相互排斥蛋白质溶解度大。 2)pH=pI时，蛋白质的净电荷为0蛋白质凝聚沉淀3 )等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。 (3)有机溶剂沉淀法1 )原理：有机溶剂可以降低溶液的电解常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，降低溶解度，同时有机溶剂和水的作用破坏蛋白质的水合膜。 2 )注意：高浓度的有机溶剂容易引起蛋白质改性失活，操作必须在低温下进行。 另外，添加有机溶剂时，要注意均匀搅拌，以免局部浓度过高。2、根据分子的大小，(1)透析和超滤1 )透析(Dialysis ) :利用蛋白质分子不能通过半透膜(Semipermeablemembrane )、小分子能够自由透过的性质，分离蛋白质和小分子物质。 作用：脱盐、无机离子和小分子物质等。 透析膜：动物膜、羊皮纸、火棉胶、玻璃纸、其他材料等。 透析是只利用盐类和小分子杂质，透析是只利用盐类和小分子杂质，2 )超滤(ultrafiltration ) :利用压力和离心力，通过超滤膜分离出不同分子量的物质的技术。 Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩(与PEG、聚乙二醇相同)。 Ultrafiltration膜：丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙等。 除去超滤小分子杂质，分离、浓缩蛋白质，也称为、加压、蛋白质溶液、半透膜、(2)凝胶色谱、分子筛色谱。 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，天然，也可人工合成。 规格因网格而异。 条件： 1、惰性、2、水不溶性、3、可高度水合。常用分子筛：葡聚糖凝胶(Sephadex )型号： G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分离大蛋白质、小蛋白质，除盐琼脂糖凝胶(瑞典的Sepharose，美国的Bio-GelA )孔径大， 用于分离大分子物质的聚丙烯酰胺凝胶(Bio-GelP ).原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，因为洗脱液从凝胶粒子间的间隙挤出下落，大分子物质的移动速度快2、小分子物质通过凝胶的眼睛进入凝胶粒子内部，所以小分子物质的移动速度慢。，(3)密度梯度离心，原理：不同粒子间存在沉降系数差时，粒子在一定的离心力下分别以一定的速度沉降，在密度梯度不同的区域形成区带的方法。 (1)电泳法，类型： 1，区带电泳纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，粉末电泳，灯丝电泳，凝胶电泳。 凝胶电泳包括琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶和聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括垂直板电泳、盘状电泳等电聚焦电泳、梯度配电电泳、免疫电泳。 2、自由界面电泳：支持体为溶液，不怎么使用。 垂直板电泳、垂直板电泳、垂直板电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr )单体和少量交联剂甲基双丙烯酰胺(Bis )化学催化剂(过硫酸铵)、四甲基乙二胺(TEMED ) 聚合后聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。 有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 连续系统：电泳系统中缓冲液的pH值和凝胶浓度相同，带电粒子在电场作用下主要依赖于电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度和电位梯度不连续，带电粒子在电场中迁移不仅具有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因此分离带的分辨率和分辨率优于前者，浓缩凝胶中的三个主要作用：浓缩效应：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳加入SDS (十二烷基磺酸钠)和少量巯基乙醇后，蛋白质分子的迁移率主要依赖于分子量，与本来具有的电荷和分子形状无关。 SDS是一种改性剂，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用。 巯基乙醇为了打开二硫键，使蛋白质分子处于伸展状态。 此时SDS在烃链和蛋白质分子的侧链合成复合体，每约2个氨基酸残基结合一个SDS分子。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，因为1，SDS为阴离子，所以复盖在多肽表面的负电荷远远超过蛋白质分子本来的电荷量，消除了本来的电荷差异。 2 .改变蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度相同，长轴长度与其分子量的大小成正比变化。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳由于不同蛋白质的SDS复合体具有相同的质量比，具有类似的构象，因此实际测定lgM=K1K2R(K1、K2为常数，R为相对迁移率)时，用几种标准单体蛋白质的分子量的对数值绘制R 、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电焦(Isoelectricfocusing )、(1)按蛋白质等电点的不同分离。 (2)凝胶包括蛋白质样品和载体两性电解质。 (3)载体两性电解质： a是一系列物质的混合物。 该混合物各成分的等电点需要相互不同，但不能太大(小数点以下2位)不同的最常用的是3.0-10.0的范围，另外是3.0-7.0、5.0-10.0 .为了使b混合物中的各物质能够按顺序排列，c混合物中的各物质在等电点必须具有足够的缓冲能力，构成成分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物d要求各组分子量小，容易与蛋白质分离。等离子体聚焦(Isoelectricfocusing )、通电后，通过在介质中h与OH-的相对移动，形成3.0-10.0的一系列pH梯度。 当载体的两性电解质移动到各自的等电点时，停止移动，不带电荷，维持pH梯度(电导、缓冲能力)。 即，pH梯度由h和oh建立，并由载体的两性电解质维持。 当蛋白质移动到适当的pH值时，它就结束了。 注意事项： 1、时间相对较长有利于分离2 .也可用于测定蛋白质的等电点。等电聚焦(Isoelectricfocusing )、等电聚焦(Isoelectricfocusing )、(2)将离子交换色谱、离子交换剂作为固定相，根据流动相中的成分离子与交换剂上的平衡离子的可逆交换时的结合力的大小的不同而分离的色谱基本原理：离子交换色谱法根据各种离子或离子化合物与离子交换剂结合力的不同进行分离纯化。 离子交换色谱的固定相是离子交换剂，不溶于水的惰性高分子聚合物基质共价键合了作为一定化学反应的电荷基团。离子交换剂分为高分子聚合物基质、电荷基和平衡离子3个部分。 电荷基团与高分子聚合物共价键合，形成带电的可离子交换的基团。 平衡离子是与电荷基团结合的反离子，与溶液中的其他离子基团发生可逆交换反应。 平衡离子带正电的离子交换剂具有与带正电的离子基团交换的作用，被称为阳离子交换剂的平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，被称为阴离子交换剂。 不同pH值的蛋白质带电情况不同。 离子交换色谱、离子交换色谱、吸附的本质：非共价键常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶解吸方式： 1、改变蛋白质的带电状态； 2 .改变环境溶液的pH、离子强度等。 根据配体的特异性，亲和色谱是利用生物分子间的特异亲和力分离的一种色谱技术。 亲和色谱是分离纯化蛋白、酶等生物高分子的最特异、最有效的色谱技术，分离过程简单、快速、分辨率高，广泛应用于生物分离。 亲和层析的基本原理：生物分子之间存在许多特异的相互作用，如我们熟知的抗原抗体、酶基质和抑制剂、激素受体等，它们之间存在完全可逆的结合力，这种结合力称为亲和力。 亲和色谱的分离原理是将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，分离纯化另一个分子就很简单。将固定在基质上的分子与配体、配体和基质共价键合，构成亲和层析的固定相称为亲和层析。 亲和色谱法的情况下，首先选择与分离的生物高分子有亲和性的物质作为配体。 例如，分离酶可以选择基质类似物或竞争抑制剂作为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体。 配体的共价键合在合适的不溶性基质如常用的Sepharose-4B等上。 使调制的亲和吸附剂柱平衡，样品溶液通过亲和色谱柱后，分离的生物分子和配体特异性结合，固定相中残留的其他杂质不能与配体结合，残留在流动相中，与洗脱液一起流出，分离为色谱柱通过适当的洗脱液从配体洗脱，得到精制的分离对象物质。.总之，粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方法的细分水平一般采用色谱法，包括凝胶断层法、离子交换断层法、吸附断层法、亲和色谱法等方法。 必要时，可采用电泳法，包括等电聚焦等蛋白质的纯化步骤。 蛋白质分子中氨基酸序列的确定、蛋白质序列的确定，主要指构成蛋白质的多肽链的数量、多肽链的氨基酸的种类、数量以及包括序列顺序在内的蛋白质的一级结构的测定。 测定序列决定要求1样品必须为纯(97%以上)知道2蛋白质分子量3蛋白质由几个肽链构成4蛋白质的氨基酸组成，根据分子量计算氨基酸的个数5测定水解液中的氨量，计算酰胺含量、蛋白质分子量的测定、最小分子量测定法，例如Mb含有0.335%的Fe时，M=55.8/0.335%=16700 . 这就是最小分子量。 实际上，真正分子量是最小分子量的n倍，n是Fe的数量，Mb的n=1，因此，M=16700； Hb用其他方法测定的分子量为68000，Hb含有4个Fe原子。蛋白质分子量的测定、渗透压法、M=CRT/、蛋白质分子量的测定、超离心法、沉降平衡法：样品溶液在分析池中低速长时间离心，分析池内的样品浓度分布达到热力学平衡时，可以根据分析池内的样品浓度分布求出分子量。 蛋白质分子量的测定、凝胶过滤法的经验式： lgM=K1-K2Ve(K1、K2为常数)使用几种已知的蛋白质测定Ve，将lgM作为标准曲线绘图。 测定未知蛋白质的Ve，得到m。 蛋白质分子量的测定，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳lgM=K1K2R(K1、K2为常数，R为相对迁移率)、氨基酸的平均分子量为128，某个蛋白质的分子量被推定为约5646的氨基酸脱水缩合而形成肽链，形成蛋白质。 每2个氨基酸脱去1个水分子(5个手指头，4个手指缝隙)，有肽链的话，有x个氨基酸的话，脱水(X-1 )。 有两个肽链的话，有x个氨基酸，会排出(X-2 )个水。 的双曲馀弦值。 的双曲馀弦值。 假定氨基酸的个数为x个，肽链为y个，脱水分子的个数为(X-y )个排列式： 128 x-18 (x-y )=5646110 x-18y=5646110 x=5646-18y由于肽链的个数有限，因此y的数字从1开始具有， x什么时候可以得到整数解(因为氨基酸、水和小数个都不可能)，例如，y=1时，因为x=51.16，实际上不可能，所以如果作为结果排出并带入y=2，由于x=51，整数解符合现实情况，所以答案是2和51，测定步骤1的多肽链的分割。 由多个多肽链组成的蛋白质分子，首先要分割。 有些多肽链是由非共价键连接起来的，被称为寡聚蛋白。 例如，血红蛋白用四聚体处理，烯醇化酶用二聚体8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，可以分离多肽链(亚基)。 测定2蛋白质分子中多肽链的数量。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量的关系，可以确定多肽链的数量。 3二硫键的断裂。 几条多肽链被二硫键交联，在尿素8mol/L或盐酸胍6mol/L的存在下，用过量的巯基乙醇处理，二硫键还原成巯基，用烷基化试剂保护生成的巯基，使其不再氧化。测定每4多肽链的氨基酸组成，计算氨基酸成分的分子比和各种残基的数量，用盐酸6mol/L、硫酸4mol/L在105