复旦大学生化噬菌体策略PPT课件

.,1,第四章噬菌体策略Phagestrategies,.,2,一些概念,噬菌体（bacteriophage）：感染细菌的病毒（virus）噬菌斑（plaque）：噬菌体裂解宿主细胞的斑裂解感染（lyticinfection）：细菌被噬菌体感染后致使细菌死亡并释放出子代噬菌体溶源（lysogeny）：噬菌体以原噬菌体形式成为细菌基因组中稳定的组分而继续存活原噬菌体（prophage）：噬菌体的基因组通过整合（integrate）成为细菌线性染色体的一部分免疫（immunity）：原噬菌体可以阻止同类其他的噬菌体感染同一个细胞诱导（induction）：原噬菌体通过诱导解除溶源化的限制,.,3,1裂解周期（lyticcycle）,有些噬菌体只有一种生存方式（strategy），在感染了一个易感宿主之后，破坏了宿主的功能而同时产生大量子代噬菌体颗粒，宿主细菌则裂解死亡一个典型的裂解周期中，噬菌体DNA（或RNA）注入宿主细胞，其基因以一定的顺序转录，并且复制出噬菌体的遗传物质，合成噬菌体颗粒需要的蛋白质成分。最后宿主细菌裂解而释放出组装好的子代噬菌体,.,4,噬菌体颗粒（particle）感染（infection）附着（attach）DNA被注射进细菌早期发育（earlydevelopment）产生DNA合成酶类DNA复制开始晚期发育（latedevelopment）产生基因组、头、尾DNA包装进头，尾附着裂解（lysis）细胞破裂释放出子代噬菌体,.,5,裂解发育的2个时期,早期发育从噬菌体DNA进入到复制开始。主要合成与DNA复制相关的酶（DNA合成、重组和修饰的酶），导致基因组不断的复制和重组晚期发育从复制开始到细胞裂解释放出子代噬菌体。噬菌体颗粒的蛋白质成分被合成（结构蛋白和装配蛋白）噬菌体通常拥有保证使噬菌体DNA优先复制的功能基因（复制起始或新的DNA聚合酶）；噬菌体的mRNA被优先转录（改变RNA聚合酶的起始和终止能力或更换RNA聚合酶）噬菌体通常利用宿主的合成机器合成自己的蛋白质,.,6,裂解发育的基因表达,早期基因（earlygene）：最初阶段必须依赖宿主转录机构表达的基因（噬箘体中为早早期immediateearlygene）中期基因（middlegene）获得早期基因编码的调控蛋白后表达的基因（或称迟早期delayedearlygene）晚期基因（lategene）中期基因编码的调控因子控制的基因,.,7,裂解表达的级联控制,噬箘体基因位置组成（遗传图谱）反映了裂解进程的次序，它的操纵子是一个极其有序的结构，编码相关功能蛋白质的基因成簇排列使得调控最为经济，使得裂解的进程能由少数的调控开关控制裂解周期受到正调控，噬菌体的基因只有接受到恰当的信号才被表达。在这个级联反应中，上个步骤合成的蛋白质将是下一个步骤要表达的基因所必须的在每个表达的阶段，一个或多个活跃的基因就是下个阶段所需的调节因子，这些调节因子可以是一种新的RNA聚合酶、改变宿主RNA聚合酶特异性的sigma因子、或是能使之通读的抗终止因子,.,8,级联控制的2种途径,转录起始：识别新的噬菌体启动子，用一种因子取代宿主酶的因子（spo1）或合成新的RNA聚合酶。新因子或RNA聚合酶生成后，早期基因表达可被终止抗终止作用：早期基因与下一期基因相邻，由终止位点隔开。如果终止作用被阻止，RNA聚合酶便通读至另一边基因，这样早期基因与晚期基因一起表达,.,9,2溶源（lysogeny）,另一些噬菌体有两种存在方式：裂解和溶源溶源的结果是原噬箘体整合到细菌基因组上，并与细菌基因一起遗传由于含有一个原噬箘体，溶源菌会对同样类型的噬箘体产生免疫，一个细菌基因组只包含一个拷贝的同一类型的原噬箘体有两种策略的噬菌体可以进行溶源和裂解生活周期的交替,.,10,溶原和裂解的相互转化,由裂解周期产生的一个噬菌体进入一个新的宿主细胞后，或者会重复裂解周期，或者进入溶源状态，这取决于感染的状态及噬菌体和细菌的基因型在诱导（induction）的过程中，原噬菌体被切除下来，从而脱离溶源生存方式约束获得自由，产生一个自由的噬菌体DNA，由此进行裂解旁路噬菌体以何种方式繁殖是由转录调节来控制的,.,11,.,12,噬菌斑（plaque）最初一个噬菌体感染一个细胞，裂解释放的子代噬菌体又感染旁边的细胞，感染的连锁反应呈放射状分布，逐渐形成一个噬菌斑烈性噬菌体形成清晰的噬菌斑温和的噬菌体形成浑浊的噬菌斑,.,13,3噬箘体的表达调控,（lambda）噬箘体基因组：48502bp线性双链DNA两端有12碱基的粘性末端（cohesivecos），进入细胞后变为环状DNADNA环化后，晚期基因在转录时是完整的噬箘体基因组编码约35个蛋白质,.,14,噬菌体的操纵子,早早期基因：PR、PL迟早期基因：PR、PL裂解晚期基因：PR、PL、PR溶源晚期基因：PRE、PaQ、PI溶源维持基因：PRM,.,15,.,16,.,17,.,18,3.1噬菌体的裂解途径,噬箘体DNA进入一个新的宿主细胞后，裂解与溶源以相同的途径启动第一阶段是利用宿主的RNA聚合酶进行早早期（immediateearly）基因的转录噬菌体只有两个早早期基因，各自独立地由宿主RNA聚合酶表达噬菌体的裂解级联反应建立在抗终止作用基础上,.,19,早早期基因的表达,从启动子PR向右转录到tR1，可以表达cro蛋白cro蛋白有双重功能：抑制阻遏物的合成（对裂解进行是必需的）关闭早早期基因的表达（在裂解周期晚期已不需要）（cro在后面还要详细介绍）从启动子PL向左转录到tL1，可以表达N蛋白pN是一个抗终止子，它作用在nut位点将允许转录过程进入迟早期基因从启动子PR向右转录到tR，无任何编码序列,.,20,.,21,抗终止（antitermination）,抗终止作用提供了病毒控制从早期基因到下一期基因表达转变的一种机制抗终止作用依赖于基因位置的特殊安排：早期基因与接下来要表达的基因非常接近，由终止子隔开如果终止子位点被抑制，聚合酶越过通读另一边的基因，同样的启动子继续被RNA聚合酶识别新基因的表达只在于伸长RNA链，使之在5端含有早期基因，在3端含有新的基因抗终止是正控制，病毒必须先合成早期基因的产物，然后才能表达下一组基因,.,22,抗终止依赖特定的位点,噬菌体的pN能分别解除终止子tR1、tL1等的终止作用pN的抗终止作用是高度特异性的，但抗终止事件并不是由终止子tR1和tL1决定的抗终止作用的识别位点在转录单位的上游，是在与作用完成的终止子位点不同的其它区域pN识别位点：nut位点（Nutilizationsite）nutL、nutR分别决定向左或向右抗终止作用,.,23,nut位点,nutL在PL的起始点和N编码区域的开始之间，接近于起始子nutR位于cro基因的末端和tR1之间，接近于终止子qut位于起始子之前这个作用涉及rho-依赖性终止子的抗终止，但是pN也可抑制非依赖终止子的抗终止作用,.,24,.,25,.,26,.,27,.,28,PR迟早期基因表达,从PR开始的迟早期（delayedearly）转录本表达转录一直到终止子tR3，除了cro外还有cII蛋白（溶源中重点介绍）O&P蛋白：噬菌体复制所必需Q蛋白：另一个抗终止因子，Q是晚期基因表达所必需的,.,29,PL迟早期表达,除了N蛋白，从PL开始的早期转录本还表达：cIII、xis、int蛋白（后面溶源中介绍）,.,30,裂解级联依赖抗终止,早早期宿主RNA聚合酶从PL、PR起始转录N和cro迟早期pN允许转录越过N和cro后继续，产生pQ晚期从Q与S间的启动子PR开始，如果缺少了pQ，晚期转录将在tR3位点终止，转录产物194nt，为6SRNApQ出现后，抑制tR3的终止，6SRNA得以延伸晚期基因的转录不在特定点终止，持续转录所有晚期基因乃至走出这个区域晚期基因左端的转录时也有相似的情形，经过重组功能区后仍继续每个方向上进行的转录可能在聚合酶撞到一块前就终止了,.,31,3.2噬菌体的溶源途径,如果要在E.coli中建立溶源，噬菌体必需做到：合成阻遏物噬菌体整合到宿主染色体上既便噬菌体选择溶源途径，早早期基因的表达与裂解途径相同,.,32,PR迟早期表达,pN作用下的迟早期转录，从PR开始一直到终止子tR3表达cII（其他蛋白在裂解中起作用，前面已介绍）cII是溶源生长所需的转录激活因子，可以激活3个启动子：PRE、PaQ和PIcII不稳定，对蛋白酶敏感cIII能够保护cII防止其降解,.,33,pN作用下的迟早期转录，从PL开始的转录表达cIII、xis、int（N蛋白不再介绍）cIII可以保护cII蛋白cII单独存在的半衰期OR2OR3邻近位点上的cI蛋白二聚体由于缔合作用而有协同效应cI蛋白的N端片段不具有协同效应,cI蛋白与操纵基因亲和力,.,61,cro蛋白的结构和功能,有66个氨基酸残基cro蛋白与cI蛋白无序列同源性，但功能相似：以二聚体形式和操纵基因结合cro蛋白也能和OR1、OR2、OR3三个位点结合和cI蛋白结合力下降的突变和cro蛋白的结合力也下降cro蛋白与3个操纵基因亲和力：OR3OR2OR1没有协同效应,.,62,cro蛋白与操纵基因的结合,.,63,cro和cI对转录的影响,cro蛋白对cI基因和cro基因的转录都起负控制作用cI蛋白对cro基因的转录起负控制作用；对cI基因本身的转录既有正控制又有负控制cro蛋白和cI蛋白相互竞争、相互制约，的调控存在于这两种蛋白的相互作用中,.,64,.,65,融合操纵子技术,构建融合操纵子质粒lacI的产物阻遏cI的表达将质粒转化到特定的溶原性E.coli中由lORPRM启动的lacZ培养基中加入诱导物-IPTG质粒表达的cI蛋白对由ORPRM启动的lacZ产生影响测定-半乳糖苷酶的活力可以衡量这种影响把PRM换成PR，可以研究cI蛋白对PR的影响把cI换成cro，可以研究cro蛋白对PRM、PR的影响,.,66,cI和cro对PRM、PR的影响,.,67,.,68,.,69,cI蛋白的自我调节,.,70,.,71,3.6.7cI蛋白的正控制机制,cI蛋白N端helix-turn-helixmotif：N端92AA，有5个-螺旋，-螺旋3嵌入到DNA大沟中，-螺旋2及-螺旋2与-螺旋3之间的非螺旋部分与RNA聚合酶结合，促进转录正控制突变分析：正控制缺陷突变（positivecontrolmutant，pc）突变发生在第2螺旋或是第2与第3螺旋的连接区pc突变的cI蛋白阻遏PR启动，失去对PRM的激活作用,.,72,InteractionbetweenthelrepressordimerandDNA.Eachlrepressorcontainsa