基因的概念重组测验互补测验

第七章基因精细结构遗传分析,第一节基因概念第二节重组测验第三节互补测验第四节缺失作图第五节断裂基因与重叠基因第五节基因功能,教学内容要点,基因的概念、重组测验、互补测验、断裂基因与重叠基因、基因的功能,难点,重组测验、互补测验与基因的功能,7.1基因概念和精细结构7.1.1基因概念的发展(1)遗传因子(孟德尔）(2)染色体是基因载体（摩尔根）(3)DNA是遗传物质（肺炎双球菌的转化实验）(4)基因是有功能的DNA片段（G.Beadle和E.Tatum:一基因一酶）(5)操纵子模型(Jacob和Monod)(6)跳跃基因和断裂基因的发现,7.1.2基因的类别和相互关系(1)结构基因(2)rRNA和tRNA基因(3)启动子和操纵基因,7.1.2基因的类别及其相互关系根据基因的功能和性质，分为:(一)结构基因（structuralgenes）与调节基因（regulatorygenes）(二)核糖体RNA基因（ribosomalRNAgenes，简称rDNA）与转移RNA基因（transferRNAgenes，简称tDNA）(三)启动子（promotor）与操纵基因（operator）前者是转录时RNA聚合酶与DNA结合的部位；后者是调节基因产物阻遏蛋白或激活蛋白与DNA结合的部位，,7.1.3基因与DNA多数肽链由150300个氨基酸组成，按三联密码子，须有450900个核苷酸对编码，加上基因内不编码的核苷酸序列，一个基因约有5006000个核苷酸对。并非DNA分子上任一含有几千个核苷酸对的区段都是一个基因，基因是一个含有特定遗传信息的DNA分子区段。特定核苷酸序列与其转录产物RNA核苷酸序列或翻译产物多肽链氨基酸序列相对应就是基因,要同时测定某一段DNA的核苷酸序列和相应产物的序列。,7.2重组测验7.2.1拟等位基因黑腹果蝇红眼由一个显性基因控制，位于X染色体上，果蝇眼睛还有许多其他颜色，如粉红色、杏色、伊红、象牙色和白色等突变型。早期研究认为控制这些眼睛颜色性状的基因是等位的，之间是复等位关系。用“”代表野生型红色眼基因，wa代表杏色眼基因，w代表白色眼基因，当杏色眼（wawa）与白眼（wY）果蝇杂交时，F1为杏色眼，如果wa与w是等位基因，F应只有两种亲本表型，但在大量F1群体中约有11000野生型红眼果蝇。红眼的出现不是突变，因为突变没有如此高频率。,进一步研究证明杏色眼基因和白眼基因虽然在染色体上所占位置相同，即位于同一基因，但属于不同位点，之间可发生交换。如杏色眼wa+/wa+x白眼w/Y，F1杏色眼。wa+/+w和wa+/Y，F1雌蝇减数分裂时发生交换形成+与waw配子，+配子与任何其他配子结合所形成的F1个体均表现为野生型红眼果蝇，因而F1群体中出现野生型个体。,对杏色眼wa+/+w与野生型+/waw两种个体进行比较发现,基因组成一样，但排列不同，前者两个突变分别在两条染色体上，为反式（trans）排列，后者则是两个突变同时排在一条染色体上，而另一条染色体上两个位点均正常，为顺式（cis）排列。,反式排列表现为突变型，顺式排列为野生型。这种由于排列方式不同而表型不同的现象称为顺反位置效应（cis-transpositioneffects），并将这种紧密连锁的功能性等位基因，但不是结构性的等位基因称为拟等位基因（pseudoallele）。拟等位基因的发现证明了基因的可分性。,7.2.2噬菌体突变型SBenzer对大肠杆菌噬菌体T4的rIIA和rIIB两个基因的结构分析，证明了基因的可分性，基因内有大量的突变子和重组子。噬菌体的突变型可归为：噬菌斑形态突变型：一些是由于侵染寄主后溶菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑（plaque）；另一些是由于被感染细菌是全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。,寄主范围突变型：噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面专一受体上，由受体基因控制，如果受体发生改变，可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的寄主范围缩小。另外噬菌体突变也可扩大寄生范围。因为决定噬菌斑形态和宿主范围突变的基因在其基因组中相当狭窄的特定区段里，大多数基因涉及生命过程必不可少的功能，所以上述突变通常是致死的。,条件致死突变型：条件致死突变型在遗传学研究中具重要意义，通过这种突变已鉴定出噬菌体的大部分基因。Benzer所用T4的rII突变就是遗传学研究中所用的第一个条件致死突变型。,T4噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称为rl，rII，rIII等，它们位于染色体DNA的不同区段，这3组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不同可以相互区别。T4rII突变使所侵染细胞迅速裂解形成大噬菌斑，所以称为rII突变型。,Benzer对rII区域的突变进行了分析：rII突变感染大肠杆菌B菌株后迅速裂解，形成比野生型大的噬菌斑，从而从大量的rll+中筛选出rll。另外rll突变型感染带有原噬菌体的大肠杆菌K（）菌株时，不产生子代，而野生型T4rII在大肠杆菌K（）菌株中能正常增殖，由此也很容易在rll噬菌体中检出rll+噬菌体，所以可检出两种不同的rll突变型之间重组频率极低的重组子。,Benzer的噬菌体重组实验DiscoveryofRecombinationWithintheGene,Benzer以T4噬菌体为材料进行了研究工作，正式提出“顺反子”这个术语,Benzer顺反子概念和基因内重组DiscoveryofRecombinationWithintheGene,Benzer将两个rIIA突变型对B株进行混合感染，再让释放的子代噬菌体感染K株。出现了野生型噬菌体。,r47r47r47+r104精细作图r47+r106r47+r102B菌株K菌株,该方法称重组测验（recombinationtest），以遗传图方式确定突变子间的关系。该法测定重组频率极灵敏，即使在106rII噬菌体中只出现一个rII+重组子，也可通过感染E.coliK()菌株的平板检查出来.,7.3互补测验7.3.1互补测验原理和方法基础遗传学研究首先须有突变型，然后分析突变型间的关系。重组测验与互补测验是确定这种关系的两个基本方法。重组测验以遗传图距确定突变的空间关系，而互补测验则是确定突变的功能关系。,如rII区有3000多个突变型都有相同表型，这是由于所有的rII突变都导致丧失合成E.coliK()发育所需要一种或几种蛋白质能力，这些突变型对E.coliK()寄主细胞致死，但可在E.coliB菌株细胞中增殖。既然它们有相同表型，是否它们都影响同一种遗传功能？rII中这3000多个突变型是属于一个基因还是属于几个基因？为划分这种功能单位界线，要进行互补测验。,用不同rll突变型成对组合同时感染大肠杆菌K()菌株：如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体（也有少量重组型的噬菌体），那么必然是一个突变型补偿了另一个突变型所不具有的功能，两个突变型称彼此互补（complementation）。如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。,互补测验斑点测试法（spottest）用一种rII突变型以0.1感染比（噬菌体1/细菌10）感染E.coliK()菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在平板，琼脂凝固后在平板上划出的一定位置上再加一滴含另一种rII突变型的培养基。在这一滴培养基范围内，一些细菌会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌斑，证明这两种突变型互补，相反不能互补。在一个培养皿平板上可做68个斑点试验。,该方法测定重组频率极敏感，重组检出率达1/106，理论上可测得0.002%的重组值，实际上所观察的最小重组频率为0.02%。根据二点杂交的结果，可作成连锁图。,互补测验结果发现，除一些缺失突变型外，rII突变型可分成rIIA和rIIB两个互补群。rllA突变型的突变位点都在rll区的一头，是一个独立的功能单位；所有rllB突变型的突变位点都在rll区的另一头，也是一个独立功能单位。凡属rIIA的突变之间不能互补；同理属于rllB的突变之间也不能互补，只有rIIA的突变和rllB的突变间可互补，双重感染E.coliK()菌株后可产生子代。说明r11A和r11B是两个独立的功能单位，分别具不同的功能，但它们又是功能互补的，要在E.coliK()菌株中增殖，两种功能缺一不可。可见rII是由于这两种遗传功能丧失而成的。,r106r51+r106+r51顺反测验r47106+r47+r106K菌株B菌株,Benzer将不同突变间没有互补的功能区称为顺顺反子（cistron）。一个顺反子就是一个功能水平上的基因，因此常用顺反子作为基因的同义词。,如rII区里rIIA是一个顺反子，rIIB另一个顺反子。每个顺反子在染色体上的区域称为基因座，而每个基因座中有若干个突变位点，是顺反子内部能发生突变的最小单位。DNA中每一核苷酸对改变都可引起多肽链中氨基酸改变，从而影响顺反子功能。它们本身没有独立的功能，在它们之间可以重组。由此可见顺反子既具有功能上的完整性，又具有结构上的可分割性。,7.3.3基因内互补互补测验中已知同一顺反子内两突变不能互补，但有例外:发生于同一基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同位点上发生变异的多肽链，而后将这两条多肽构成双重杂合子，两者配合起来，可表现程度不同的恢复酶活性部位，称为基因内互补（intrageniccomplementation）。,基因内互补对互补测验存在一定干扰，通过研究发现，基因内互补与基因间互补可区分开：基因间互补普遍存在，而同一基因内不同位点突变绝大多数不能互补，只有少数例外。基因内两个突变能互补的只能是点突变，无缺失，突变一定是错义突变，不是无义突变或移码突变；基因内互补作用的酶活性明显低于正常水平，最多只有野生型酶活性的25，形成的蛋白质常有某种异常，如温度的稳定性或pH依赖性等。,7.4缺失作图7.4.1缺失作图原理Benzer研究rII突变型时发现一些突变由于核苷酸对发生改变，称点突变(pointmutation)。而另一些突变由于缺失相邻的许多核苷酸对，称缺失突变(deletionmutation)。尽管两种突变形成相同表型效应，但有区别：点突变是单个位点突变，缺失突变是多个位点突变（multisitemutation）；点突变可发生回复突变，而缺失突变不可逆；点突变与其他点突变间可发生重组，而缺失突变同另一个点突变间不能重组，因为相应片段已缺失。这个杂交中没有一个基因组在这个点突变位置上正确的核苷酸对，无法通过重组而恢复野生型核苷酸顺序。,7.4.2缺失作图方法0.5mlE.coliB菌株培养物加1滴缺失型噬菌体和1滴待测rII突变噬菌体，几分钟后取一滴菌液加在灭菌纸条上，铺在长有E.coliK(A)菌株平板上，经培养如在纸条覆盖区域内形成清晰噬菌斑，说明它们之间发生重组，产生野生型噬菌体，阴性结果就说明子代中重组体非常低，空白对照出现几个噬菌斑是点突变回复突变产生的。通过两个步骤把未定位的rII突变定位在rII区域某个小片段上。第一步将待测突变型与“大缺失”突变型分别进行杂交，以确定这一突变位点所属大范围；第二步将待测突变型进一步与有关“小缺失”突变型分别进行杂交，以缩小这一突变点所属的范围。,如待测突变型rII548，第一次杂交结果说明它和缺失突变型A105和638发生重组，而与其他5个不发生重组，确定这一突变位点在区域A5中；第二步与A中3个缺失突变型1605、1589、PB230分别进行杂交，同一原理可把rII548进一步定位在A5某一位置上。用该方法已绘制出r11区域自发突变的精细结构图。P203,可见测定每一个rII突变型位置需做两次实验，虽然每次实验要做若干杂交组合，但杂交在同一培养皿上用滴加法进行，实际测定工作很简单。适用于测定大量突变型定位，只需确定这些突变型彼此间的位置。这一方法还可应用选择性培养方法提高效率，而且杂交后只需观察能否重组，而无须统计重组子的多少。,这一方法也适用于其他基因定位。Benzer根据这一原理方便地把数千个独立的rII突变定位在rII遗传图上更小的区段内，这种方法称为缺失作图（deletionmapping）。比重组作图简便且精确。因为重组作图工作量大，为了确定一个新突变的位点，往往要进行大量杂交分析。,缺失作图须有一组重叠缺失突变系作工具，把要测定的突变型和这一系列缺失突变型分别进行重组测验。凡能和某一缺失突变型进行重组的，它的位置一定不在缺失范围内，凡不能重组的，它的位置一定在缺失范围内。Benzer所选择的一组缺失突变就将rll区划分成47个片段，只需做十几个杂交，而且只要记录E.coliK()平板上是否出现重组体，就能将一个新的rII突变位点定位在rII区47个片段中。,7.5断裂基因与重叠基因,7.5.1外显子与内含子传统观点认为每一结构基因是一段连续的DNA序列。法国Chambon（1977）和美国Berget首次报道基因内部有间隔顺序（spacesequence）。提出断裂基因（splitgene）概念。指基因由几个互不相邻的段落组成，内部被长达数百个乃至上千个核苷酸对的间隔序列（内含子）隔开。自从在猴类病毒SV40和腺病毒中发现断裂基因以后，又发现珠蛋白基因、卵清蛋白基因、免疫球蛋白基因、tRNA基因、rRNA基因均是断裂基因。高等真核生物基因多数都有内含子，只有少数基因没有内含子。原核生物的基因一般无内含子。,1977年Flavell和Jeffreys将兔珠蛋白基因mRNA反转录成cDNA，然后再与珠蛋白基因杂交，结果发现珠蛋白基因片段比cDNA大两倍，说明珠蛋白基因内部含有不属于cDNA的片断，即不出现在mRNA分子中的非编码序列。同年，Chambon对鸡输卵管的卵清蛋白基因做了同样的实验，并在电子显微镜下观察，得到了直接证据和相同的结果：,鸡卵清蛋白基因（ovalbumingene）mRNA比该基因DNA短很多。用该mRNA与卵清蛋白DNA杂交，或者先以mRNA为模板反转录出互补cDNA，然后用这种cDNA与卵清蛋白DNA杂交，再用电子显微镜观察照相，结果表明A、B、C、D、E、F和G等DNA序列在成熟的mRNA中未能反应出来。,DNA是完整的，只是有些片段找不到可和它配对的mRNA，于是这段DNA拱起来。拱起来的DNA序列可能未转录，至少在成熟的mRNA序列中没有这部分DNA的转录产物。将DNA序列中被转录成为mRNA的片段称为外显子（exon或extron），而在成熟mRNA未转录的DNA区段为内含子（intron）。卵清蛋白基因含7个内含子，将基因分隔为8个外显子，还有一前导序列。由此Gilbert提出基因是由被表达的外显子镶嵌在沉默的内含子中的一种嵌合体，而且内含子的核苷酸数量可比外显子多510倍。,7.5.2断裂基因的意义研究表明，真核生物基因中存在断裂基因具有普遍性，那么在进化中又有什么意义？有利于储存较多的信息，增加信息量。一个基因只转录出一种mRNA，但是一些断裂基因以不同剪接方式可产生两种至多种mRNA，编码不同功能的多肽。如SV40的同一段DNA在一种情况下读成一种蛋白质，在另一种情况下读成另一种蛋白质。,有利于变异和进化。虽然单个碱基改变有时可引起氨基酸改化而造成蛋白质变化，但很难产生重大改变而形成新蛋白质。如果这些单个碱基突变发生在密码子第三位上往往沉默，突变效应会大大降低。而断裂基因中如果突变发生在内含子与外显子结合部位，就会造成剪接方式改变，结果使蛋白质结构发生大幅度变化，从而加速进化。,增加重组机率。内含子可能不断增减造成新的剪接方式。一方面形成新基因，另一方面在剪接过程中增加重组频率；同时断裂基因中由于内含子的存在，基因长度增加，重组频率也增加。可能是基因调控序列。内含子可能在基因表达中有一定调控作用，在基因转录水平上以及在合成mRNA以后的加工过程中起着调控基因表达的作用。,总之，断裂基因是具有十分重要的生物学意义的，但是对它的功能还不是完全了解。如：剪接作用是通过什么机制来识别内含子与外显子的结合特定位点？如果通过酶进行，那么这种剪接酶是否有特异性？一种酶还是多种酶参予作用？因为这种剪接必须十分准确，只要切错一个核苷酸，就会使密码全部弄错。,内含子是一次切除还是多次切除？切除的RNA命运又如何？是否可作为形成mRNA的原料？内含子是如何形成？有人认为一切生物原来都有内含子，但原核生物由于基因组小，复制快，内含子成为快速复制的包袱，因此逐渐失去；相反的看法认为生物体本来没有内含子，由于外显子改组（shuffling）位置不准确而形成内含子。这两种看法都有一定的旁证，但仍难作出正确判断。这些问题都有待进一步研究。,7.5.3重叠基因（overlappinggene）的发现重叠基因：两个基因的核苷酸序列完全重叠或部分重叠的情况，即一段核苷酸片段被两个基因重复使用的现象。1973年哈佛大学Weiner首次发现E.coli的Q病毒有两个基因编码蛋白质从一个起点开始。1977年Sanger测定出噬菌体x174核苷酸序列为5375bp（现5387），它编码9种蛋白质的aa长度明显超过5375bp能编码的aa最大数目，后来发现了其基因组中有多种重叠的情况。,（一）大基因内包含小基因。如B基因完全包含在A基因内；E基因在D基因内，由于密码读框不同而得到不同蛋白质。（二）前后两个基因首尾重叠。如D基因终止密码子最后一个核苷酸是J基因起始密码子的第一个核苷酸；还有前后重叠两个核苷酸，如A基因与C基因之间就重叠两个核苷酸。（三）3个基因之间三重重叠。Shaw（1978）对噬菌体G4核苷酸序列分析时发现3个基因间的三重重叠。（四）反向重叠。DNA双链都转录，密码读框相同，但方向不同，所以形成不同的蛋白质。不过这两者的转录相互干扰，表达一强一弱。（五）重叠操纵子。重叠基因不仅结构基因之间重叠，也有结构基因与调控序列重叠，以及调控序列之间重叠，如大肠杆菌中的md和ampC两个相邻的操纵子的重叠。,普遍认为重叠基因不仅能经济有效利用DNA遗传信息量，“节约”碱基，而且更重要的是便于对基因表达起调控作用。如Trp操纵子中imp基因翻译依赖于上游基因trpE的翻译，称为翻译偶联（tanslationalcoupling）。因为trpE的终止密码子与imp的起始密码子重叠。这种重叠密码子是保证同一个核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。实验证明，翻译偶联是一种调控机制。,已知噬菌体MS2和猿猴病毒SV40都具有重叠基因。显然这些病毒可以用有限DNA执行更多的遗传功能，这是提高遗传物质效率的一种适应性表现。,高等真核生物中也有重叠基因，一个基因的内含子是另一个基因的编码序列。在果蝇中，编码果蝇蛹的角质层蛋白基因，位于编码嘌呤代谢路线中一种酶基因的内含子序列中。,近年来人的基因中也发现重叠基因