细胞生物学-13细胞增殖及其调控

细胞增殖的功能细胞增殖是生物繁育的基础（增加个体数量，多细胞生物繁衍）。,第十二章细胞增殖及其调控,维持机体细胞数量和功能的相对平衡。（更新衰老、凋亡和受损的细胞）,大剂量的X射线照射老鼠，老鼠几天内死亡。（导致干细胞大量死亡，个体在细胞数量上特别是功能上受损。）,细胞增殖是通过细胞周期来实现的，细胞周期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证的。细胞无限制增长对个体来说意味着癌症，个体无限制繁殖对地球来说意味着灾难。,第一节细胞周期概述一、细胞周期细胞周期指细胞从一次分裂结束开始，经过物质积累过程，至到下一次分裂结束为止，称为一个细胞周期。正常情况下，沿着G1SG2M期运转。细胞周期除了可受生物种类和细胞种类的影响外，还可受温度等周围环境条件的影响。,就高等生物体的细胞而言，细胞周期时间长短主要差别在G1期，而变化最大。S期、G2期和M期则相对稳定。,标准的细胞周期,在胚胎发育过程中，细胞不但在机能上彼此分工，增殖行为也出现差异，根据细胞繁殖状况，可将机体内所有细胞相对地分为3类：周期中细胞（连续分裂细胞）细胞周期连续运转。如部分骨骼造血细胞、小肠绒毛上皮腺窝细胞、表皮基底层细胞等。,静止期细胞（G0期细胞、休眠细胞）；暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但在适当刺激下可重新进入细胞周期的细胞（周期中细胞转化为G0期细胞多发生在G1期）。如某些免疫淋巴细胞、肝、肾细胞及大部分骨骼干细胞等。终末分化细胞。分化程度很高，一旦生成后，则终生不再分裂。如神经、肌纤维细胞、血液多形核白细胞等。,细胞周期G0期细胞分裂之后，某些细胞离开细胞周期。执行某种生物学功能或进行细胞分化；当受到某种适当的剌激后，它们会重返细胞周期，进行分裂增殖。,二、细胞周期中各个不同时期及主要事件G1期（DNA合成前期）G1期合成细胞生长所需要的各种蛋白质、糖类、脂类等，但不合成DNA。在G1期的晚期阶段有一个特定时期。通过这个特定时期，细胞分裂进入S期。在芽殖酵母中，这个特定时期被称为起始点。在其它真核细胞中叫检验点或限制点(R点)。G1期时间变化较大的根本原因具有一个调节细胞增殖周期开和关的“阀门”，即限制点。,特点：大量合成物质决定细胞周期时间决定细胞的前途,起始点被认为是G1期晚期的一个基本事件。细胞只有在内在和外在因素共同作用下才能完成这一基本事件，进入S期。外在因素很多，如各种生长因子、营养物质、射线等，可调控细胞周期进程。内因主要是与cdc基因调控过程相关的因素有关。此种基因的有序表达，是受到一些控制点调控和监视的。cdc基因的产物是一些蛋白激酶、磷酸酶等。,细胞分裂周期基因（cdc）基因：细胞周期沿着G1SG2M的顺序运转，不同时期出现不同的关键性事件，这是基因有序表达的结果，这种完成细胞周期中特定阶段所需要产物的编码基因，叫cdc基因。限制点：是真核细胞细胞周期控制G1期进入S期的调节点，可以限制细胞通过周期，所以称其为限制点，简称R点。,检验点不仅存在于G1期，也存在于其他时期，如S期检验点、G2期检验点、纺锤体检验点等。这些特异的监控机制（检验点）可以监别细胞周期中的错误，并诱导产生特异的抑制因子，阻止细胞周期进一步运行。,S期S期即DNA合成期。新的组蛋白也是在S期合成的。DNA的起始和复制过程受到多种细胞周期调节因素的严密调控。真核细胞新合成的DNA立即与组蛋白结合，共同组成核小体串珠结构。G2期细胞核内DNA的含量已经增加一倍。其它结构物质和相关的亚细胞结构也已进行了进入M期的准备。但细胞能否顺利地进入M期，要受到G2期检验点的控制。,细胞分裂间期有哪些主要特点？最明显的特征是进行DNA的复制，其次是进行RNA和蛋白质的合成，为有丝分裂作准备。间期可分为G1期、S期、G2期。其中G1期最重要，G1期的限制点（R点）是控制细胞增殖的关键，决定了细胞的3种不同命运：继续增殖细胞，细胞通过R点，继续进行增殖，保持旺盛的增殖活性，分化程度低，周期时间较为恒定；暂不增殖细胞，细胞长时间停留在G1期，合成大量的特异性DNA和蛋白质，在结构和功能上发生分化。随后，代谢活性下降，处于G0期，但并没有丧失增殖能力，在适宜的条件下被激活成增殖状态；不再增殖细胞，细胞丧失了增殖能力，始终停留在G1期，结构和功能发生高度分化，直至衰老死亡。,细胞通过R点后，就加速合成DNA复制所必须的各种前体物质和酶，DNA解旋酶和NDA合成因子也急剧增加，为进入S期DNA复制作准备。S期的主要特点是DNA复制和组蛋白、非组蛋白的合成，是整个细胞周期中最关键的阶段。G2期中加速合成RNA和蛋白质，其中最主要的是合成有丝分裂因子和微管蛋白等有丝分裂器的组分。另外，细胞成分如磷脂的合成增加并进行ATP的积累，为有丝分裂进行物质的准备。,M期M期即细胞分裂期。真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式，即有丝分裂和减数分裂（成熟分裂）。三、细胞周期长短测定脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法流式细胞仪测定法,四、细胞周期同步化细胞同步化是指自然的，或经人为选择或诱导产生的细胞周期同步化。前者称为自然同步化，后者称为人工同步化。人工同步化是指人为地将处于不同时期的细胞分离开来，从而可获得不同时期的细胞群体。分为选择同步化和诱导同步化。选择同步化主要是有丝分裂选择法。经单层培养可获得一定数量的M期细胞。另一个方法是密度梯度离心法。,从培养细胞中收集M期细胞的同步化方法,什么是选择同步法？有哪些方法？选择同步法是用物理方法将处于细胞周期中同一阶段的细胞从非同步的群体中分离出来的方法。又分为:有丝分裂选择法:使单层培养于培养器皿中的细胞处于对数期增殖，此时细胞分裂活跃，分裂指数高，分裂细胞变圆、隆起，与培养器的粘着性降低。此时轻轻摇动，M期的细胞就脱离器皿壁而悬浮于培养液中。倾出培养液于40C保存。再加入370C新鲜培养液继续培养，经1-2小时，再如同上法收集M期的细胞。每1-2小时摇一次，收集一次，可获得一定数量的M期细胞。,此法的优点是不受药物影响，同步化程度高。缺点是分离的细胞少。细胞沉降分离法:由于细胞在其周期过程中，体积逐渐增大，所以处于细胞周期不同阶段的细胞体积不同。而细胞在某一离心力场中的沉降速度与其半径平方成正比，因此可用沉降法分离所处周期时相不同而大小不同的细胞。此法优点可适用任何系统，包括悬浮培养的细胞。缺点是同步化的程度有限，因同一时相的细胞大小并非都是一致的。,应用过量的TdR阻断法进行细胞周期同步化,诱导同步化DNA合成阻断法：用DNA合成抑制剂可逆地抑制DNA合成而不影响其它各期细胞沿细胞周期运转，最终将细胞群体阻断在S期。TdR双阻断法最常用，细胞最终阻断于G1/S交界处。,中期阻断法某些药物可抑制微管的聚合，因而抑制有丝分裂器的形成，将细胞阻断在有丝分裂的中期。同DNA合成阻断法相比，中期阻断法的非平衡生长的问题并不十分明显，因M期大分子合成基本停止。但此种阻断法的可逆性较差，阻断时间较长，获得的细胞中的一些细胞将不能完成正常的有丝分裂而出现异常分裂。常用的阻断药物是秋水仙素或秋水仙酰胺。,分裂中期阻断法利用秋水仙素等药物，抑制有丝分裂器的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期。五、特殊的细胞周期早期胚胎细胞的细胞周期酵母细胞的细胞周期植物细胞的细胞周期细菌的细胞周期：快速分裂与慢速DNA复制,第二节细胞分裂一、有丝分裂有丝分裂是一个核改组的连续过程，人为地分为6个时期。前期从染色质浓集成早期染色体到核膜破裂，同一染色体中的两条染色单体互称姊妹染色单体。含两条染色单体的染色体叫二分体。在每条染色体上，都有一段特殊的DNA序列，称为着丝粒DNA。其所在部位称为着丝粒（主缢痕）。,分裂间期,中心体在间期也进行了复制。中心体与周围的微管一起被称为星体。细胞分裂开始，两个星体即逐渐向细胞的两极运动。在动物细胞有丝分裂前期时，两对中心体连同其组装的星体沿核膜彼此远离，达到相对位置时决定了细胞分裂极，两极之间在靠近核膜处形成初步的纺锤体。前期末，核纤层蛋白磷酸化，核纤层解组引起核膜破裂，纺锤体进入核区。核仁逐渐缩小，消失。,前期两个中心体向两极移动,有丝分裂器：有丝分裂中产生的由微管及其结合蛋白所组成的星体和纺锤体。,星体：围绕中心粒向四周辐射的微管。,中心粒,星体微管,中心体,纺锤体：由大量微管纵向排列组成中间宽，两极缩小的纺锤状结构。,纺锤体微管,极微管（连续丝）,横桥,染色体微管,着丝点,极微管,染色体微管,区间微管,有丝分裂器功能：在维持染色体的平衡、运动、分配起着极为重要作用。,前中期核膜破裂，标志着前中期的开始。染色体进一步凝集，变粗变短，形成明显的X形染色体结构。纺锤体的装配。中期所有染色体排列到赤道板上，纺锤体呈典型的纺锤样。此期是观察染色体形态，数目最佳时期。,前期形成的染色体排列在细胞中央的赤道板处此时，染色体很清晰，每个染色体由两条染色单体构成，被着丝点连接；染色体在细胞中部排列，着丝点位于同一平面上，此期是观察染色体形态，数目最佳时期。,秋水仙素,抑制微管聚合,纺锤体形成,可获得大量有丝分裂中期细胞,进行,染色体研究,纺锤体完全形成，并移向细胞中央。,有丝分裂器,染色体,纺锤体,中心体,确保遗传物质平均分到两个子细胞中,左，前中期；右，中期,中期，右图显示与染色体联接的微管,后期后期开始，几乎所有的姊妹染色单体相互分离，此时每条染色单体为子代染色体。着丝点纵裂，每条染色体的两条姐妹染色单体分开。此时，每条染色单体因具有一个独立的着丝点所以称为一条染色体，由一分子DNA组成。在微管的作用下，两组染色体分别向两极移动，形成两组子染色体。此时，移向两极的两组染色体数目，形态完全相同。,微管作用过程第一，动粒微管（染色体丝）正极不断解聚，染色体丝缩短，使染色体向极移动（后期A）。第二，极微管（连续丝）的正极加速聚合，伸长微管相互滑动，使纺锤体两极之间距离加大（后期B）。染色体分离异常，常发生于后期微管的解聚与聚合异常。,后期A染色体分离，后期B两极延伸,后期姊妹染色单体分离,末期染色体平均地分到两极，即进入末期。核膜开始重新装配（在这个过程中，许多蛋白去磷酸化，包括H1组蛋白和核纤层蛋白的去磷酸化，导致核膜小囊泡在染色体表面上结合，最后形成核被膜）。染色体去螺旋化，分散在间期核中，核仁重新出现。,染色体解螺旋，逐渐变为细线；染色体逐渐分散，形成染色质；核膜、核仁再次出现，纺锤体消失，各自形成一个新细胞核。,末期,胞质分裂开始于细胞分裂后期，完成于细胞分裂末期。动物细胞胞质分裂开始时，在赤道板周围细胞表面下陷形成环状缢缩，称为分裂沟。分裂沟逐渐加深，直至两个子代细胞完全分开。肌动蛋白和肌球蛋白参与了分裂沟的形成和整个胞质分裂过程。在分裂沟的下方，除肌动蛋白之外，还有微管、小膜泡等物质聚集，共同形成一个环状致密层，称为中间体。胞质分裂机制，和肌肉收缩机制相似。,动物细胞的胞质收缩环,胞质分裂过程可以简单地归纳为4个步骤：即分裂沟位置的确立、肌动蛋白聚集和收缩环形成、收缩环收缩、收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞。,胞质分裂过程,植物细胞植物细胞有细胞壁，其胞质分裂，新壁的形成与动物细胞不同。,有丝分裂过程,间期,核膜,核仁,染色质,中心粒,前期,中期,后期,末期,赤道板,收缩环造成的分裂沟,动物细胞的有丝分裂,间期,前期,中期,后期,末期,微管解聚学说：,染色体向两极运动的机理：,微管滑动学说：,植物细胞的有丝分裂,经过上述一次有丝分裂过程：细胞分裂一次，DNA复制一次，染色体同时也分裂一次，并且平均分到两个子细胞中，因此每个子细胞都含有与原来母细胞相同的染色体数，这样保证了有丝分裂产生的子细胞都保持了与母细胞相同的全套遗传物质，从而保证了机体所有细胞的染色体数（遗传物质）的恒定性。,有丝分裂,与有丝分裂直接相关的亚细胞结构中心体中心粒是圆筒状小体，筒壁为9组三联微管组成。在动物细胞分裂时，与确定分裂方向有关的细胞器是中心体。中心体由一对中心粒及其周围的无定型物质构成。中心体在G1末期开始复制。G2期开始分离，G2晚期到M期，子中心粒不断长大，逐渐分离到两极的两对中心粒具微管组织中心的作用，组织形成纺锤体及星体。,动粒与着丝粒动粒（着丝点）是附着于着丝粒上的一种细胞器。在S期复制，电镜下为一个圆盘状结构，分内、中、外三层。主要由蛋白质组成，并有少量的RNA和DNA，是有丝分裂时纺锤体微管附着于染色体的部位。着丝粒是指染色体主缢痕部位的染色质。由卫星DNA构成。,纺锤体纺锤体是细胞分裂过程中的一种与染色体分离直接相关的细胞器。组成纺锤体的微管可以分为三种类型，即动粒微管、星体微管和极性微管。,微管解聚学说：,染色体向两极运动的机理：,微管滑动学说：,有丝分裂过程中染色体运动的动力机制1、染色体整列2、染色体分离,马达蛋白和微管系统共同协作，使染色体分离。,三、减数分裂是一种特殊的有丝分裂方式。生殖细胞在成熟过程中发生减数分裂。其特点是，DNA复制一次，然后发生两次连续的有丝分裂，导致最终生成的细胞的染色体数减半。通过受精作用又恢复二倍体，减数分裂过程中同源染色体间发生交换（有同源染色体的配对，不同对同源染色体分裂时的自由组合，非姊妹染色单体间DNA片断交换、重组），使配子的遗传多样化，增加了后代的适应性，因此减数分裂不仅是保证生物种染色体数目稳定的机制，同且也是物种适应环境变化不断进化的机制。,减数分裂模式图,前减数分裂间期最大特点在于S期持续时间较长。另一个重要特点是，在植物百合中发现，其前减数分裂间期的S期仅复制其DNA总量的99.7%-99.9%，而剩下的（DNA小片段）0.1-0.3%要等到减数分裂前期才进入复制。另外还发现，在一种L蛋白，在前间期与上述DNA小片段结合，阻止其复制。,减数分裂过程减数分裂期前期根据细胞形态的变化，又可将前期人为地划分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期等5个阶段。细线期（凝集期）染色质开始凝集，但乃呈单条细线。染色体呈细线状，具有念珠状的染色粒。持续时间最长，占减数分裂周期的40%。细线期虽然染色体已经复制，但光镜下分辨不出两条染色单体。由于染色体细线交织在一起，偏向核的一方，所以又称为凝线期。,偶线期（配对期）持续时间较长，占有丝分裂周期的20%。主要发生同源染色体配对，此过程称为联会。联会的同源染色体间形成一种特殊结构叫联会复合体（synaptonemalcomplex，SC）。在光镜下可以看到联会的一对同源染色体共有4条紧密结合在一起的染色单体，称为四分体。另一个重要事件是合成在S期未合成的0.3%的DNA。,联会复合体：减数分裂前期染色体配对时，同源染色体之间形成的一种复合结构，既有利于同源染色体间的基因重组，也有利于同源染色体的分离。,粗线期（重组期）持续时间长达数天，染色体明显变粗，同源染色体之间发生DNA片段交换，在SC的梯状结构中出现重组节，通过重组节发生活跃的重组过程。双线期（合成期）同源染色体分开，但有几点相连，这时第一次看到四分体。同源染色体之间的接触点称为交叉。每一个四分体上至少有1个交叉。,二价体显著变短，并向核周边移动，在核内均匀散开。所以是观察染色体的良好时期。,终变期（再凝集期）染色体更加变粗。交叉明显，数量减少。交叉向染色体的端部移行，称为端化。核膜、核仁消失。纺锤体形成。,中期同源染色体的每一对姊妹染色单体在着丝粒处并连在一起，1对动粒朝向同一极，同源染色体的两个染色体通过动粒微管分别连向不同的极。四分体逐渐向赤道方向移动，最终排列在赤道面上。,后期同源染色体的两个染色体分离，分别移向一极。每极的染色体数比亲代细胞减少了一半，为1n。第1染色体为1二分体，仍由2条染色单体组成，因而每极的DNA含量仍是2C（C代表1个基因组或单倍的DNA量）。末期，胞质分裂和减数分裂间期细胞进一步的变化主要有两种类型：染色体到达两极，并逐渐进行去凝集。核被期重新装配，形成两个子细胞核。此时的间期细胞不再进行DNA复制，称减数分裂间期。,细胞进入末期后，不是完全回复到间期阶段，而是立即准备进行第二次减数分裂。第一次分裂后，产生2个细胞。有的生物细胞质不分裂。减数分裂与有丝分裂过程基本相同，可分为前、中、后、末期。通过第二次分裂，每个核的DNA含量又减少一半，为1C。经过第二次减数分裂，共形成4个单倍体细胞。高等动物雄配子与雌配子的发生有所不同，雌性动物通过减数分裂形成4个有功能的精子，后者只形成一个有功能的卵子，其余3个细胞变成极体。,减数分裂过程的特殊结构及其变化性染色体的分离联会复合体的基因重组联会复合体是同源染色体之间在减数分裂前期联会时所形成的一种临时性结构，由中央成分组和位于两侧的侧成分共同构成。主要成分是蛋白质，另外DNA、RNA也是联会复合体的组成成分之一。,第三节细胞周期的调控,细胞周期,一、MPF的发现及其作用（促使细胞从G2进入M期）MPF，即卵细胞促成熟因子，或细胞促分裂因子，或M期促进因子。将M期细胞和不同时期的间期细胞溶合，诱导间期细胞产生形态各异的染色质凝集，称之为染色体超前凝集（PCC）。此种染色体则称为超前凝集染色体。,这种现象提示在M期细胞中可能存在一种诱导染色质凝集的因子称为细胞促分裂因子或M期促进因子。,人类M期细胞与袋鼠G1、S和G2期细胞融合诱导成熟染色体凝集,PCC形态反映该细胞在间期所处细胞周期位置:G1期PCC为单线状,因DNA未复制。S期为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。G2期为双线染色体，说明DNA复制已完成。,G2期开始出现能引起蛙卵母细胞生发泡破裂（GVBD）的因子，同时引起染色质凝集，这种促成熟活性物质（MPA）在G2M过渡期达到峰值。这种诱导减数分裂成熟的物质称为有丝分裂因子（MF），以后在其它细胞也提取出类似的MF，后将这类物质统称为细胞周期调控因子（MPF）。在成熟的卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟。将这种物质称作促成熟因子，即MPF。,非洲爪蟾卵细胞成熟过程、受精和第一次卵裂示意图,成熟卵细胞质移植发现MPF的存在,G2,M,中期,MPF活性与细胞周期的关系,二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系cdc2基因是裂殖酵母细胞中最重要的基因之一。也是第一个被分离出来的cdc基因。在裂殖酵母细胞周期调控过程中，p34cdc2激酶起着关键性调节作用。在芽殖酵母中，也有一个关键性的cdc基因，称为cdc28。是第二个被分离出来的cdc基因。p34cdc28也是一种蛋白激酶，和p34cdc2一样，在G2/M转换过程中起着中心调节作用。,cdc2D表示过度表达；cdc2-表示cdc基因缺失。,Cyclin、cdc2与MPF的关系,MPF主要含有P32和P45两种蛋白。P32和P45结合后，表现蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。因而证明，MPF是一种蛋白激酶。,MPF含有两个亚单位，即Cdc2蛋白和周期蛋白。当两者结合后，表现出蛋白激酶活性。Cdc2为其催化亚单位，周期蛋白为其调节亚单位。MPF：控制细胞周期，促进成熟的因子。由两个亚基组成，一种是细胞周期蛋白，另一个是周期蛋白依赖性的蛋白激酶，其中周期蛋白为调节亚基。正是由于不同的细胞周期蛋白和不同的基因产物的结合、分离、磷酸化与去磷酸化、激活催化亚单位的激酶活性，而成为驱动细胞周期运转的引擎。,三、MPF的激活,四、MPF（或活化的M-Cdk）的功能,诱导纺锤体装配；启动染色体的凝聚；促进核被膜解体；细胞骨架重排；高尔基体、内质网重组。促使细胞从G2期进入M期。,三、周期蛋白人们已经从生物体中分离出了数十种周期蛋白，在哺乳动物