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第8章 细胞重组与克隆技术8.1 细胞重组8.1.1 细胞重组定义指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。8.1.2 细胞重组的特点与意义8.1.3 细胞重组方式细胞重组的方式基本分为以下三种：（1） 胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。（3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。8.1.4 细胞重组材料的获得8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得定 义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。制取容器及条件结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。8.1.4.2 核体的获得定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。 核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。 制备方法：8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得定 义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。8.1.5 显微操作技术 借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。 8.2 克隆技术 植物界吊兰动物界孙悟空8.2.1 克隆(clone)的定义 本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术核移植。克隆的三个层面分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础 细胞全能性。 细胞的分化。植物界*克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。*试管植物。*花药培养。*基因克隆植物基因工程的核心 动物界*与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。 *尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认识，人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。 克隆技术的里程碑*首只体细胞克隆动物“多莉”(Dolly)羊的成功证明了成熟的体细胞也具有全能性。 8.2.3 哺乳动物克隆的技术方法 *胚胎分割*胚胎嵌合*胚胎干细胞核移植*胚胎细胞核移植*胎儿成纤维细胞核移植*体细胞核移植分析胚胎分割和胚胎嵌合不属于真正意义上的克隆，严格说属于胚胎工程的范畴。其它方法都是涉及细胞核移植，只是细胞核来源不同而已。 8.2.4 细胞核移植技术（一）定义是利用显微操作仪，将一个细胞（核供体细胞）的细胞核移入另一个去核细胞（核受体细胞）中，经人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。即胞质体与核体的重组。是目前最常用动物克隆技术，是哺乳动物体细胞克隆的核心技术8.2.4 细胞核移植技术核供体细胞：胚胎细胞、胚胎干细胞、胎儿成纤维细胞、体细胞。（其中以胚胎细胞克隆最为普遍，而以体细胞的克隆意义最大）核受体细胞：去核的卵母细胞、受精卵、2-细胞胚胎8.2.4 细胞核移植技术（二）发展历史1938年，德国胚胎学家汉斯.施佩曼（Hans Spemann）博士，最早提出核移植的构想。没有实现1952年，美国人罗伯特.布里格斯（Robert.Briggs)和T.J.金，利用两栖类卵细胞建立了细胞移植技术8.2.4 细胞核移植技术（三）核移植技术操作过程*核受体细胞的准备*核供体细胞的准备*细胞核移植*激活*重组胚的体内或体外培养*胚胎移植 核受体细胞的准备去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。因为在卵母细胞的细胞质中含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化的细胞重新回到原点，同受精卵一样开始个体发育过程。卵母细胞的来源一是，用激素进行超排处理再从输卵管冲出成熟的 MII卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘-卵母细胞复合体，在体外培养成熟后作为受体。核受体细胞的去核化学处理紫外线灭活染色体显微手术法核供体细胞的准备细胞核供体细胞必须是完整的二倍体。首先必须保持有供体动物完整的二倍体，其次必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分裂过程的倒转，变的如同刚刚受精的合子一样，能够重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。细胞核移植胞质内注射用一个外径5-8um的注核针吸取供体核后，直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，然后用电刺激进行细胞融合。激活重组胚的体内或体外培养经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养的方法获得桑葚胚和囊胚。大鼠、小鼠和兔多作体外培养，发育至桑葚胚或囊胚。胚胎移植重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与共体品种不同、繁殖能力强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植入代孕母畜的子宫内，待其发育到产仔。移植的部位：输卵管和子宫角移植的方法：同于体外受精8.2.4 细胞核移植技术（四）类 型根据核供体细胞来源的不同，可以将细胞核移植分为：胚胎细胞核移植胚胎干细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植体细胞核移植胚胎细胞核移植将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的卵母细胞融合，发育成胚胎后，移入受体妊娠产子。目前经此法已克隆出：小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛、猴等胚胎干细胞核移植将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分化培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞称谓胚胎干细胞。再利用核移植技术，从理论上讲，可以比胚胎核移植生产更多的动物个体。目前，仅小鼠成功胎儿成纤维细胞核移植从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。1996年，英国用此法克隆出3只山羊。体细胞核移植（体细胞克隆技术）将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞中，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。20世纪50年代，克隆出成体蛙1997年英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司的胚胎学家伊恩.维尔穆特博士的研究小组克隆出雌性小绵羊“多莉”8.2.5 克隆羊多莉1996年7月5日，生物学界发生了一件轰动世界的大事克隆羊多利诞生。这一成果被美国科学杂志评为该年度世界10大科技进步的第1项。科学家认为，多利诞生标志着生物技术新时代来临。此后，克隆，这个以前只在科学研究领域出现的术语变得广为人知。克隆猪、克隆猴、克隆牛纷纷问世，似乎一夜之间，克隆时代已来到人们眼前。这是克隆技术领域的一项重大突破，利用这一技术可以大批复制某一动物，其影响不可估量。美国科学杂志评出的1997年世界十大科技成就，多莉羊荣登首席克隆羊多利的诞生，是科学界的一个里程碑，在它的后面有是什么呢. .8.2.5.1 具体操作过程取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊（芬兰多塞特白品种绵羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。注射促性腺激素Gn促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）排卵，2833小时取其未受精卵快速去核，放入10%FCS（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS连续5天，饥饿使进入G0期做受体细胞。 在乳腺细胞注射Gn3436小时后与无核卵放入同一培养皿中，在微电流作用下，将乳腺细胞核融入卵中，形成一个含有新遗传物质的卵细胞。将新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育成桑椹期胚胎或囊胚（816个细胞），再移入假孕母羊子宫内。产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。8.2.5.2 多莉羊克隆成功的原因解决了使核供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。以前的失败是两者细胞周期不匹配，胚胎早期细胞大多停留在S期或G2期，而卵细胞大多停留在二倍体的中期，两者细胞不同步，使形成的胚胎可能发生DNA的额外复制，提早复制的染色体导致非整倍体及胚胎的异常发育。而伊斯维姆.穆特用饥饿法用饥法减缓细胞生长速度使两者进入G0期。同步后便于融合，使胚胎正常发育。8.2.5.2 多莉养克隆成功的原因解决了用体细胞做核供体与传基因的问题由于体细胞大多停留在G0期，这为细胞同步提供了方便。同时，在受体细胞中导入目的基因，可进一步生产转基因动物。8.2.5.3 多莉羊与以往克隆动物的最大区别是它的核供体是高度分化了的体细胞乳腺上皮细胞，而不是尚保留细胞全能性的早期胚胎细胞。8.2.5.4 多莉羊的重要的生物学意义已分化的体细胞在一定的条件下，可以恢复失去的全能性而形成完整个体。打破了哺乳动物已分化的体细胞不具有细胞全能性的传统概念。多莉的的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳动物的最后技术障碍已被突破，在理论上成为可能。提示我们，在培育供体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确的植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们可以按照人的意志去改造、生产物种。8.2.5.5 多莉羊的真实性科学工作者不希望科学实验出现无意差错，更不希望发生有意差错。科学需要真实，科学来不得半点虚假，真正的科学是经得起时间检验的8.2.6 克隆技术的应用与意义 检验动物细胞全能性 加速动物繁殖、优良育种、曐护珍贵动物。医药领域克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。可以用患者本人细胞培育出新组织。最新进展灵长类动物克隆成功华人科学家于2000年左右成功利用胚胎分裂法复制两只恒河猴。这是人类第一次克隆出与人最类似的灵长类动物。 *转基因克隆技术 *转基因新物种，但繁殖？*克隆快速繁殖，但创造性？*两者结合？转基因克隆哺乳动物，使之成为用途广泛的“活体生物反应器” 。*大大降低转基因动物制作的技术难度和投入成本。*当今动物克隆技术最重要的应用方向之一是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 克隆技术存在的问题*技术上尚不成熟*得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。*目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。克隆动物的体细胞突变、寿命及其它遗传问题 *克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。 *克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。 是否是完全的“复制”？1、克隆则是一个过程，克隆产生的个体还需进行胚胎发育和胎后发育。克隆与其原本尽管基因相同，所处环境却绝不会相同。2、虽然克隆个体是由核移植产生的，但由于重建细胞的细胞质并非来自原本，而我们知道细胞质中也有遗传物质，它们必然会对个体产生影响，所以不能把克隆个体看成是原本的复制品。是否是倒退？可应用性*有性生殖是历史进化的结果，利于种族繁衍和生存。*选择无性生殖克隆的方式不利于遗传多样性的保护。社会学和伦理学问题成龙问克隆人，我是谁？一个例子人+动物中山医科大学陈系古教授等于2001年1月以来，先后使用“核移植”技术，将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过多次实验，成功克隆出多个人类胚胎，其中部分发育到“桑葚胚”阶段。这是国际上首次用该技术克隆出人类胚胎。但有些学者就对在家兔卵母细胞中克隆出人类胚胎的提出质疑，认为这是违背人类伦理的“科学”实验。克隆人制备过程科学家们计划将普通的男性细胞或者是主体细胞和一枚女性卵子结合起来，储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名男性的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性子宫中。当然，如果一对夫妇愿意的话，也可以克隆女性。克隆的漫漫长路1938年汉斯.斯皮曼建议用成年的细胞核植入卵子的办法进行哺乳动物克隆。1952年运用斯皮曼的构想，出现世界上第一只克隆青蛙。1962年约翰.格登宣布他用一个成年细胞克隆出一只蝌蚪，从而引发了关于克隆的第一轮辩论。1984年斯蒂恩.威拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊。这是第一例得到证实的克隆哺乳动物。1996年第一个用成年哺乳动物细胞克隆出的个体克隆羊多莉出世了。1997年美国总统克林顿决定5年之内禁止用联邦基金资助克隆人的计划。2000年美国科学家用无性繁殖技术成功地克隆出一只猴子“泰特拉”，这意