几种菌种的保存及复苏方法

多株保存和恢复方法(包括扩增方法)也称为斜面培养，穿刺培养，液体培养等继代培养保存法。将菌株接种在适当培养基上，在最佳状态下培养，充分生长后，在4 6 保存，以一定间隔进行移植培养的菌种保存方法。程序如下：1准备徽章1.1准备碗有些玻璃器皿，例如三角瓶、试管、培养皿、烧瓶、吸管等，在清洗、干燥、包装和灭菌后使用。1.2溶解培养基成分首先在烧杯里放入适量的水，根据培养基配方取各种材料，将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等放入水中溶解，然后放入足够的水充分搅拌。调整1.3 pH值成分溶解后用室温冷却培养基，必要时用稀酸(0.1毫升/L盐酸)或稀碱(10%氢氧化钠)调节pH值。添加酸性或碱液的时候，慢慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸，防止不正确的测量和营养成分被破坏。1.4凝固剂固体培养基的制备需要琼脂、明胶等凝固剂。将凝固剂放入液体培养基中加热，继续搅拌直到融化，补充蒸发的水分。1.5装扮过滤器在2层纱布中间夹上面具，趁热将配好的徽章分开装。倾斜培养基分为试管高度的大约四分之一(4 5毫升)，穿刺培养基的试管高度的一半合适。在化妆过程中，防止徽章污染喷嘴，使其浸入棉花塞，以免造成污染。1.6绷带标记试管加棉塞，外部绷带牛皮纸或铝箔，徽章名称和准备日期。1.7杀菌根据需要灭菌培养基，通常蒸汽灭菌为121，15 20min。1.8坡度放置灭菌后及时放置斜坡最好不要超过试管长度的1/2。1.9无菌检查将灭菌培养基放入培养箱中进行灭菌检查，通常在30 培养1 3天。灭菌检查通过后保存在4 。接种2种疫苗2.1坡度疫苗接种2.1.1点连接把菌株连接在坡度中间的部分下面。适用于扩散型生长和绒毛气体生成菌丝真菌(如毛霉、根霉等)。2.1.2中央虚线在斜坡中央自下而上画直线。适用于细菌、酵母等。2.1.3细波状曲折标记方法从斜向下到向上绘制“的”字形行。也适用于容易扩散的细菌或一些真菌。2.1.4致密波状曲折标记方法从倾斜的底部自下而上绘制“的”字形行。充分利用边坡，获得大量细菌细胞，适合细菌、酵母等。2.1.5挖掘接种法将菌丝体与少量培养基一起挖出来，返回新鲜的边坡。灵芝和其他担子菌。2.2朋克免疫用接种针从原种坡度中选择少量菌体，从柱状培养基中心向下刺，沿着圆锥路径慢慢提取接种针，直到接近管子底部(不要穿到管子底部)。适用于细菌、酵母等。2.3液体接种选择少量高固体倾斜菌株，或用无菌滴管等采集原菌液，接种到新鲜液体培养基上。3培养接种后，将培养基放入培养箱，培养适合细胞稳定期，或获得成熟孢子。细菌培养温度通常为30 37 ，真菌培养温度通常为25 28 。4保留培养的菌株在4 6 保存，并根据需要每3 6个月移植一次。芽酵母、阿舒假囊酵母、棉病囊菌等特定菌需要1 3个月移植一次。储存湿度以相对湿度表示，通常为50%至70%。斜面菌应该保存第三代培养菌，防止事故污染造成的危害。液体石蜡保存法也称为光油保存法，定期移植保存法的辅助方法。将菌株接种在适当的倾斜培养基上，培养菌株强壮的群体时，注入灭菌液体石蜡，复盖整个斜面，然后直立保存在低温(4 6)干燥处的菌种保存方法。程序如下：1液体石蜡的制备选择高质量的化学纯液体石蜡，分发液体石蜡，用牛皮纸包好，用以下两种方法灭菌：121湿热灭菌30分40 孵化器中蒸发水分，经过灭菌检查后准备。160 干燥热灭菌2小时，冷却后灭菌检查后初步。2斜面培养物的制备参阅定期移植法。石蜡3注入将灭菌状态的液体石蜡注入在灭菌状态下培养的新鲜倾斜培养物中，液体水平在倾斜顶部1厘米左右，使菌体与空气隔离。4保留注入4.1液体石蜡的菌株斜面以直立状态保存在低温(4 6)干燥处。保留期为2-10年。4.2保留期应定期检查，如培养基显示液体水平，并及时补充灭菌液体石蜡。5恢复培养培养恢复后，选择少量菌体，放入适当的新鲜培养基中繁育，然后再转化。3.标准细菌的恢复、恢复和标准初步菌株的制备3.1项目和试剂：免疫针、酒精灯、吸管、酒精75%、酒精75%棉3.2徽章Aspergillus Niger复苏，为复苏改良马丁琼脂培养基：念珠菌复苏术，用于回春。用于产气荚膜梭菌复苏和回肠的液体聚乙二醇酯培养基：营养肉局徽章：包括：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌b、芽孢杆菌短、铜绿假单胞菌3.3程序：A.打开清洁工作台。B.用75%的酒精擦拭放大器的外部，使其自然干燥。C.用小砂轮在放大器上画出线，用手轻轻摘下放大器(打开放大器时可能会损坏，所以要小心)。D.将0.5 0.8ml从准备好的上述液体培养基移至灭菌吸管。E.轻轻旋转放大器，充分混合冻干菌种和液体培养基，完全溶解。F.用灭菌吸管将琥珀内菌液全部传递到相应的液体培养基。G.根据安瓿上显示的不同种类，培养到适当的温度(细菌培养温度30 35，培养18 24小时；真菌培养温度23 28，培养3 5天。浑浊与否，混浊表明菌株的复苏生长。未混浊的细菌应延长培养时间为7天，真菌应延长培养时间为14天，如果未混浊，则应延长灭菌处理。H.黑曲霉的细菌悬浮液在常温下溶解菌管内液后，用灭菌吸管1 2滴进行改良，粘在马丁琼脂斜面上，用吸管涂上，23 28 ，培养5 7天，倾斜的正面应均匀，呈黑褐色，无杂色，斜面无色，接近菌层培养基，不能有黄色。确认后，包含0.05%(ml/ml)的tween -80的0.9%无菌氯化钠溶液，用于无菌试管。I .上述细菌在恢复后从8-10毫升液体培养基复制到g。杀菌菌株中100ml20%的无菌甘油混合，将1-2ml/管分离到冷冻保存管中。每株准备10种，按顺序编号，最后以质量管理官进行质量管理，据此确认。剩下的由预备官做。黑曲霉的h-抗溶液采用h-抗法着装，由服装后孢子悬浮液20ml制成。在恢复的菌株中加入20毫升，30%的无菌甘油混合，1-2毫升/管存档作为灭菌技术。准备10种，按顺序编号，最后以质量管理官进行质量管理，即据此确认。剩下的由预备官做。将上面准备的冷冻保管管按季度贴上标签。这包括菌种名称、菌种代码、编号、世代、准备日期、作者、储存条件、有效期等。J.备用菌株已成功准备，保存在-20 ，有效3年。3.4菌株鉴定将细菌培养菌培养菌接种到质量管理管中营养琼脂培养基平板或相应的菌生长期，分离个别群体。然后在30 35 下培养2 3天。用同样的方法将真菌带到玫瑰钠琼脂培养基板，在23 28 培养7天。培养后观察其种群的形态，应符合其菌种的形态特征。3.5污染处理如果在这个板块上确认其他种群生长，则被污染，或者菌株表现为不纯，或者被操纵。灭菌污染的培养物。可以找到将纯集落转换坡种分回到第四代的原因。重新准备备用菌株3.6菌株的继代和保存如果在被称为第一代的新培养基上接种菌株，原菌株会再次融化，转移到新培养基上生长。也就是说，被认为是一次传代，从物种保存中心获得的冻干菌株转换为0代，冻干原菌株转换为1代。3将维持在第一代，直到取代工作菌种。菌株的传递次数(原冻干粉后)不能超过5代。菌种的传代保存工艺3.3个下属标准细菌的复苏是前一代，服装是第二代。第三代自然解冻了一个冷藏库，将斜坡种连接成工作用菌株。此时，工作菌株是第三代。工作用菌株分为两类。一个用于常规系(W3)，另一个用于实验(S3)。替代细菌的定期转移阶段如下(坡度免疫法)。(1)在冰箱冷冻室去除菌株赦免后，要在室温下放大约30分钟。(2)在新制造的培养基保存管墙上注明细菌名称和接种日期后，与鸡菌种一起打开外灯1小时，转移到清洁工作台。(3)关闭紫外线灯。点亮酒井灯，用左手抓住菌株边坡，将喷嘴靠近火焰，右手拿着接种棒背面注射了约30秒钟，然后将棒状金属部分燃烧在火焰中往返。(4)右手拿着无名指、小指、手掌的管帽，左手在火焰中转动喷嘴加热，右手轻轻地拔出管帽，把注射环伸进去靠在靠近墙的琼脂斜面上，稍微冷了以后，对着细菌苔藓，稍微刮了一下细菌苔藓，然后拿出接种棒，将菌种管口移动到火焰上。(5)插上管塞，左手放下菌株管，取一个营养琼脂斜面(或改良马丁琼脂斜面)，如上所示打开管塞，将预防环伸进去，在琼脂斜面底部画一条直线，从底部到顶部画一条连续的曲线，将细菌涂敷到斜面上，接种到斜面表面。(6)取出接种环，在火上用塞子盖住培养基管，然后将接种细菌的接种环放在火上消毒。(7)将接种的细菌管放置在30 35细菌培养箱22 24h小时，将真菌管放置在23 28 ，培养真菌培养箱最多7天。工作用种群系代数小于5时，下一代作用菌株可以直接传递给上一代作用菌株，例如，(W3)可以直接转换为(W4)。按照以上程序重新接种，直到(W4)转换为(W5)，销毁旧工作菌株。菌种斜面培养、保存条件和时间菌种培养条件和时间培养基保存条件和时间大肠杆菌(CMCC (b) 44102) 30 35 22 24h营养琼脂培养基2 8，保存3个月金黄色葡萄球菌(CMCC (b) 26003) 30 35 22 24h营养琼脂培养基2 8保留3个月芽孢杆菌(CMCC (b) 63501) 30 35 22 24h营养琼脂培养基2 8保留3个月铜绿假单胞菌(CMCC (b) 10104) 30 35 22 24h营养琼脂培养基2 8保留3个月沙门氏菌paratipi b(CMCC)50094)30 3522 24h营养琼脂培养基2 8保存3个月Clostridium perfringens(CMCC(b)64941)30 3522 24h营养琼脂培养基2 8保存3个月Candida坎迪达(CMCC (f) 98001)在23 28 下最多改善7天，马丁琼脂培养基在2 8下保留3个月Aspergillus Niger (CMCC (f) 98003)在23 28 下最多改善7天，马丁琼脂培养基在2 8下保留3个