酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定.ppt

酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定,指导老师：李作美,班级：2012级食品质量与安全学生：芦雯学号：51206041015,目录,背景,酸奶是日常生活中的一种传统的受欢迎的发酵型的乳制品，它的营养价值含量相当的丰富，并且对人体有很好的保健功效。,意义,蒙牛冠益乳中的乳酸菌主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。测定乳酸菌的OD值和产生酸能力来评定酸乳中乳酸菌的活力，对乳酸菌活力的测定，判定酸奶的最佳饮用时间，为酸奶的消费提供科学的依据，同时也对微生物做出研究。,1.概述,2.材料与方法,材料与设备,实验方法,酸奶中乳酸菌的培养分离,1培养基的配制称取MRS琼脂培养基66.2g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，加热煮沸后，装入锥形瓶中，121高灭菌15min备用。2菌悬液的配制（1）拿1支洁净的锥形瓶，加入225mL的生理盐水；（2）取7只洁净的试管，各盛9mL的生理盐水；（3）塞上棉塞，用报纸包裹扎紧后，放入103kPa、121高压蒸汽灭菌20min；（4）用玻璃棒将酸奶样品搅拌均匀，吸取酸奶25mL，加入放有225mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，让酸奶样品均匀散布，这就是10-1的酸奶样品稀释液；（5）将7支盛有9mL生理盐水的无菌试管，分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，利用无菌移液管吸取10-1的酸奶样品稀释液1mL，分别加入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，再次稀释，得到10-2稀释液，同理得到10-3-10-8的样品稀释液。,3倒平板把经高温高压灭菌的MRS琼脂培养基冷却到45左右，按无菌操作法倒7只平板，倒平板时注意量的把握，浅浅的一层，待凝固。4分离方法用一支1mL无菌移液管分别吸取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的稀释菌悬液各1mL，分别接种在与之相对应的7个无菌平板中，每个平皿放稍许；马上用无菌玻璃涂棒将样品菌液均匀地涂布在平板，放置一段时间后，将之倒置，最后放入37恒温箱中培养48h。5菌落观察恒温培养48h过后，取出培养平板；观察培养基内菌落的形态，找出乳酸菌菌落。6镜检选取一块干净的载玻片，在载玻片的中央滴加一滴生理盐水，在无菌操作法的环境下，用接种环挑取少量乳酸菌涂片；结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染，干燥后用油镜观察。,生化试验鉴定乳酸菌,糖发酵试验试验方法：在无菌操作的环境下,用接种环挑取一定的量培养基上的乳酸菌,使之接种在发酵液体的培养基的试管中。在完成接种任务后,将乳酸菌培养基试管放入培养箱中培养。每天定时观察试验结果,观察培养基内颜色有没有发生变化，即有没有产酸。查看小倒管中有没有气泡产生,若出现微小气泡，也可视为产气阳性。我们有的时候还能观察到接种的乳酸菌有没有动力,如果有动力,乳酸菌培养物就能飘散着生长在培养基中。将麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗糖和葡萄糖五种糖的发酵培养基，分别加入试管中，高度约为整个试管的三分之二。分别用接种环挑取MRS琼脂培养基中的乳酸菌的疑似菌落接种在这几个试管中，放入二氧化碳培养箱中培养2-3d（37）。各种生化指标的鉴定，获得乳酸菌的生化特性。,酸奶中乳酸菌菌落数的测定,（1）配置酸奶溶液吸取1ml酸奶于一支标有10-1标号的无菌生理盐水中配成1：10的稀释液。（2）稀释吸取lmL混合均匀的1：10的酸奶稀释液加入标有10-2标号试管内，同理作10倍递增稀释液。吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8八个梯度的酸奶稀释液，依次放入相应的无菌平皿中，每个平皿放浅浅的一层。(3)倒平板平皿中加入稀释液后，马上把冷至45左右的改良TJA培养基加入平皿中，用1mL无菌生理盐水作空白对照，等待培养基凝固之后，把平板倒置，放入恒温培养箱中培养，温度在37左右，培养时间为48h。(4)观察计数：观察乳酸菌菌落的形态特点，把菌落数在30-300之间的平板挑选出来，开始计数。则1mL检样中乳酸菌数为：(N1+N2)XA/2注：单位是：cfu/mLN1、N2-平行平皿中乳酸菌落个数A-稀释倍数,挑选出乳酸菌生长繁殖适宜的三个培养基平板，将培养分离出来的乳酸菌菌株，用接种环挑取一定量的菌种，将它接种在MRS培养基中，将之分别标号为1、2、3，然后将之放入恒温培养箱中，进行摇床培养。每隔2h测量一次乳酸菌的OD值，直至OD值不再明显变化为止。并通过实验所得到的OD值，绘制出乳酸菌的生长曲线，最后观察每个生长期的变化，找出指数期的时间段。,活力的测定是指该菌种产酸能力，把正处在指数生长期的乳酸菌按3%的量接种到60mL的新鲜牛奶中，然后每隔2h测定一次牛奶的酸度变化，直至牛奶酸度变化不再明显。,生长曲线的绘制,产酸能力的测定,3.结果与分析,酸奶中乳酸菌的分离培养,经过对乳酸菌菌落的观察，发现在MRS琼脂培养基的7个平板上，10-7稀释度的菌落观察是最好的。经过MRS琼脂培养基分离的菌株,有较大的菌落、透明、呈灰白的颜色、两面是凸起来的。镜检进一步观察，革兰氏染色阳性，油镜下观察，呈杆状的为保加利亚乳杆菌，呈链状并且为一个一个小球形的为是热链球菌。,糖发酵试验,嗜热链球菌的生化鉴定结果,保加利亚乳杆菌的生化鉴定结果,生理生化试验结果,酸奶中乳酸菌的菌落数测定结果,用直接计数法，记录每个平板的菌落数，然后计算每个样液同一稀释度下的两个平板的平均菌落数。观察计数发现稀释度在10-7时计数最适宜，菌落数在30-300之间。酸奶样品测定在出厂间隔时间为3d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为295、297；酸奶样品测定在出厂间隔时间为6d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为273、271；酸奶样品测定在出厂间隔时间为9d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为212、213。,所以酸奶菌落总数为：样品的测定与出厂的间隔时间为3d：N=(N1+N2)XA/2=（295+297）X107/2=296X107cfu/mL样品的测定与出厂的间隔时间为6d：N=(N1+N2)XA/2=（273+271）X107/2=272X107cfu/mL样品的测定与出厂的间隔时间为9d：N=(N1+N2)XA/2=（212+213）X107/2=213X107cfu/mL实验分析：酸奶中所含的乳酸菌数，随着出厂天数的延长会出现明显下降的趋势。,结果分析：到10h时，三个平板的酸奶中的乳酸菌的OD值均不再明显变化，说明乳酸菌生长到了对数生长期。,生长曲线的绘制,酸奶中乳酸菌的OD值,根据酸奶中乳酸菌的OD值，分别绘出三个平板中的酸奶中的乳酸菌的生长曲线,结果分析：由上图乳酸菌的生长曲线可得，乳酸菌的生长指数期