DNA重组技术的基本工具精品PPT精选文档

1,专题一基因工程,2,假如你是一位育种专家，你能培育出下面几种“生物”吗？请问你准备用什么方法？,3,这些定向改造基因的设想能实现吗？,经过多年的努力，科学家终于在20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程,4,一.基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向改造生物,基因重组,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的。因此又叫做DNA重组技术。,5,1.1DNA重组技术的基本工具,三种基本工具,剪刀,针线,运输车,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,运载体,6,问题探讨：,普通棉花抗虫棉,7,基因工程培育抗虫棉的简要过程,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌（有抗虫性状）,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),重组DNA,导入,形成,培育抗虫棉的关键步骤有哪些？,8,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,9,主要来源：,（1）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,原核生物,限制酶就是细菌的一种防御性工具，切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,简称：,限制酶,分布：,主要在原核生物中,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,二.基因工程的工具,10,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,限制酶在原核生物中的作用,11,T,磷酸二酯键,A,2、作用特点：,12,13,2、作用特点：,识别特定核苷酸序列,切断两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,具有特异性。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,（1）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,3、限制酶识别序列,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,14,思考与探究P7,2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,15,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,16,限制酶所识别的序列的特点,中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,EcoR,Sma,3、限制性核酸内切酶的作用特点,能识别特定核苷酸序列；,（专一性）,17,3、限制性核酸内切酶的作用特点：从特定部位的两个核苷酸之间切开。（切点：磷酸二酯键）,T,A,（专一性）,18,Sma,平末端平末端,4.限制酶的作用结果：,EcoR,黏性末端,黏性末端,4.限制酶的作用结果：,EcoR,黏性末端,黏性末端,重复演示,22,EcoR,黏性末端,黏性末端,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶EcoR能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,23,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,24,Sma,平末端平末端,限制酶Sma能识别GGGCCC序列，并在G和C之间切开。,25,平末端,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,26,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,EcoR,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,酶切,27,（1）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,4.作用结果：,产生黏性末端或平末端,28,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,29,（2）“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,32,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,（2）“分子缝合针”DNA连接酶,33,DNA连接酶,寻根问底P6,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,34,DNA聚合酶,35,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)能将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,36,【探规寻律】几种酶的作用部位限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶作用于部位,DNA解旋酶作用于部位。,37,（3）“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体：质粒动植物病毒（3）噬菌体的衍生物,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,（最常用）,38,质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且有自我复制能力的双链环状DNA分子。,39,40,常用的载体质粒：,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,独立于细菌拟核DNA之外的一种可以自我复制的小型环状的DNA分子,41,1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,42,小结,限制酶,主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键产生黏末端或平末端