第三章-微生物药物的产生菌PPT课件

.,1,微生物药物研究的一般流程,筛选模型的建立,产生菌的筛选,菌种保藏,菌种选育,发酵培养,产物的分离，纯化,结构鉴定,药学评价,工业化生产,作用机理研究,产生菌的获得,.,2,第三章微生物药物的产生菌,链霉菌：氨基环醇类、聚酮体类、多肽、核苷类,芽孢杆菌属：多肽类假单胞菌属：含氮杂环类粘细菌：epothilone曲酶：降血脂药洛伐他丁青霉属：青霉素、灰黄霉素类,主要产生菌,.,3,自链霉素发现以来，抗生素的总量飞速增加，至2002年，从微生物中分离了超过22,000种生理活性物质，其中包含20,000种抗生素，放线菌（80%为链霉菌）占45%，真菌占38%，其他单细胞细菌（主要为假单胞菌和枯草杆菌）占17%。另外一组数据是至2002年，放线菌来源的抗生素约8700种，真菌来源的4900种，而其他来源的细菌2900种。两个统计大致相似。,.,4,放线菌的丝状结构,放线菌为革兰氏阳性菌,可形成类似霉菌的细长丝状菌体。,.,5,电境下的放线菌,.,6,青霉菌的产孢结构,.,7,第一节抗菌药物产生菌的筛选,真菌细菌海洋微生物甚至极端环境微生物,设定不同的培养基和培养条件可以选择性地分离：,.,8,抗生素的早期鉴别,抗菌谱(根据抗菌作用的不同):广谱抗生素抗革兰氏阳性菌的抗生素抗革兰氏阴性菌的抗生素抗真菌抗生素,.,9,纸层析的八大溶剂系统：BuOH(H2O)BuOH(H2O)+2%PTSA(4-toluenesulfonicacid)BuOH:HAc:H2O(2:1:1)BuOH(H2O)+2%六氢吡啶用BuOH饱和的0.5mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液H2O(BuOH)+2%PTSA苯:甲醇(4:1),滤纸用0.5mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液处理75%甲醇，25%水(内含3%NaCl),滤纸用5%硫酸钠处理,快速鉴别的方法：纸层析和纸电泳颜色反应紫外吸收光谱,.,10,细菌细胞壁合成抑制剂(细胞壁为革兰氏阳性菌所特有，人体细胞没有，因此有较好的选择性)：支原体D-丙氨酸-D-丙氨酸二肽合成抑制羧肽酶抑制糖肽类抗生素的筛选(二乙酰基-L-赖氨酸-D-丙氨酸-D-丙氨酸抵消万古霉素的作用)细菌自溶酶诱导剂,根据作用机理建立筛选模型:,.,11,细菌叶酸代谢抑制剂DNA回旋酶抑制剂：回旋酶为维持DNA超旋状态所特有改变细胞膜通透性物质：增加通透性，使得药物进入细胞作用于细胞外膜作用于细胞外排泵：抑制菌体对药物的外排抗生素钝化酶抑制剂的筛选:b内酰胺酶抑制剂，氨基环醇类抗生素钝化酶,链霉素乙酰转移酶针对不同的菌种来源，而有着特定的方法。,.,12,在新药研究过程中,通过化合物活性筛选而获得具有生物活性的先导化合物，是创新药物研究的基础。,筛选：制药工业发现新药的源泉之一传统筛选:一次性筛选样品量少、速度慢、模型少,.,13,许多药物作用的受体已被分离、纯化,一些基因的功能及相关调控物质被相继阐明,这使得许多在生命活动中发挥重要作用的生物大分子可以直接成为大规模药物筛选的新模型,使得药物筛选模型从传统的整体动物、器官和组织水平发展到细胞和分子水平。筛选方法和技术发生了根本性的变化,出现了高通量筛选的新技术、综合应用自动控制的机器人,基于新的科学原理的检测手段和计算机信息系统等技术,以酶活性、受体结合及受体功能的变化作为检测指标,在极短时间内即可完成庞大数量的化合物活性筛选,大大加速了新药的寻找和发现过程。,.,14,随着分子生物学的发展，大量的允许作为新药靶标的蛋白被克隆，利用细胞做为体外筛选系统成为可能，同时机器人和自动化系统的利用和发展，高通量筛选就应运而生。高通量药物筛选是使用机器人和自动化系统,从大量的样本中鉴别出对确定的分子靶标有作用的少量活性化合物的一种技术。被筛选出来的化合物可作为先导化合物进一步研究而开发成为新一代安全、有效的新型药物。,高通量筛选(HTS,HighThroughputScreening),.,15,高通量药物筛选平台的组成：化合物库、靶体选择、靶体和化合物反应的测试方法的建立、靶体作用物的高通量筛选和数据的信息处理系统。通过对种类繁多的合成及天然化合物作针对各种药物靶体的筛选，从中寻找最佳的先导化合物，进而用于新型药物的开发。特点：规模大、速度快、成本相对较低，缩短新药开发周期并可找到最佳新药。,.,16,荧光高通量筛选系统,细胞表面受体键合作用分析荧光免疫酶标分析(FLISA)细胞毒性分析(Cytotoxicityassays)细胞凋亡筛选分析,.,17,在筛选过程种，应注意随时与已知化合物的数据库，如JournalofAntibiotics的NovelAntibioticsDataBase进行比较。以免重复工作或得到无优势活性的化合物。,.,18,1997,Stackerbrabdt根据16SrRNA/rDNA序列分析结果:,第二节微生物药物产生菌的分类,放线菌(actinomycetes)广泛分布于自然界，分枝状菌丝，G+C含量高。,细菌域(Bacteria)厚壁菌门(Firmicutes)放线细菌纲(Actinobacteria)放线细菌亚纲(Actibacteridae),.,19,瑞典博物学家林奈誕辰300周年2004,.,20,基因组DNA的(G+C)%(鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔分数百分比)核酸分子杂交(DNA-DNA,DNA-rRNA)rRNA核苷酸序列分析基于限制性酶切技术的DNA指纹技术基于PCR技术的DNA指纹技术。,基因水平,.,21,同一个种内的不同菌株G+Cmol%含量差别应在45%以下同属不同种的差别应低于1015%，差别10%不是同种。,.,22,原理：根据DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性，将待测的不同来源的DNA在体外加热使其解链，并在合适的条件下使互补的碱基重新配对，然后测定百分率（以同源%或碱基相似性%表示），此百分比越高，表明两者间碱基顺序的同源性越高，即亲缘关系越近。如同一种，应为100%。,DNA-DNA杂交,核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。,.,23,从受试菌中提取DNA,两两混合，其中之一标记，未标记的过量加入以避免标记DNA自身退火。将对照的放射性强度作为100%,根据杂交的多少进行分类。,.,24,分离细胞提取总DNAPCR扩增序列测定序列比较/blast系统发育树的构建,通过16SrRNA核苷酸序列分析，进行分类和构建系统发育树已成为现代分类工作的主要内容。,.,25,在富盐培养基上生长的变形细菌16SrDNA系统发育树,.,26,PhylogenyoftheLivingWorld-Overview,.,27,基因组测序?！,454sequencingtechnology(,.,28,美国典型菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)/.,世界著名的菌种保藏中心,美国农业研究服务菌种保藏中心(AgriculturalResearchServiceCulture,ARS)/.,.,29,ATCC收藏种类繁多，几乎涵盖了所用的生物种类：细菌、噬菌体、细胞株和杂多瘤、丝状真菌和酵母、植物种子、原虫、藻类、病毒和抗血清、动物、植物等。ATCC鼓励世界各地将生物体保存在ATCC,它同时为研究人员提供收费服务。2004年ATCC开设了新加坡和香港两个亚洲发布中心。,ATCC和ARS,ARS最早是作为专利菌株的保存地，其规模和收藏的生物体种类远远少于ATCC。只有霉菌、原核生物（主要是细菌）、酵母等三类。其专利菌株未列出。,.,30,ATCC和ARS的菌株都有一个编号，如雷帕霉素产生菌Streptomyceshygroscopicussubsp.hygroscopicus（吸水链霉菌吸水亚种)为ATCC29253和NRRL5491。,NRRL是NorthernRegionResearchLab的缩写，与ARS相互指代。,.,31,英国国立标准