鸡神经病靶酯要点PPT课件

成年鸡神经病靶酯酶的同一性和特征描述,制作者:吕飞燕2009.05.25,.,2,Contents,小结,实验结果,所选用的材料与方法,文章的主要内容总结,文章出处及作者简介,.,3,文章出处及作者简介,文章出处：GENE2009.01作者及其简介：常平安，伍一军等伍一军，男，安徽桐城人。佐治亚医学院分子医学与遗传学系基因调控专业博士后，现任中国科学院动物学研究所研究员，中科院研究生院教授，博士研究生导师。主持分子毒理学实验室，专业方向为分子毒理学，主要研究领域为神经毒理学、环境毒理学以及药物引起的神经疾病。主要研究兴趣在于环境有害化学物质的神经毒性机制；神经病靶标酯酶引发迟发性神经毒性的分子机理；,.,4,文章的主要内容总结,这篇文章主要讲NTE的基因排序。NTE的基因中的活性部位。NTE的基因中不同部位被GFP标记后主要在哺乳动物中的分布。GFP标记的cNTER可以被macroautophagy和蛋白酶体这两种东西破坏，而导致其含量下降。,.,5,NTE的概念及其基本特点,神经病变靶标酯酶(neuropathytargetesterase,NTE)是在研究有机磷化合物引起的迟发性神经病变(organophosphate2induceddelayedneuropathy,OPIDN)的发生机制过程中发现的。通常认为NTE的抑制和“老化”是OPIDN发生的前提。NTE是一个由1327个氨基酸组成的跨膜蛋白。将不同的NTE肽段在大肠杆菌中重组表达,发现具有有机磷敏感性和戊酸苯酯水解活性的重组多肽至少含有727-1216氨基酸序列,这一重组多肽被称为NTE酯酶活力域(NTEesterasedomain,NEST)。以往的研究结果提示,NTE除了具有酯酶活力外,NEST在神经细胞分化和神经系统发育中起着重要作用。NTE不仅存在于脑、脊髓和周围神经，在外周淋巴细胞内含量也很高。,.,6,所选用的材料与方法,成年鸡及各个实验用的一些基本试剂。,1.分子克隆鸡NTE基因的调控序列。2.鸡NTE序列的扩展和延伸。3.质粒的构建4.细胞培养和转染5.给细胞施加MG132,AC,3-MA,雷帕霉素等处理因素。6.Westernblotting分析。7.NTE活性检8.共聚焦显微镜测定,简介,.,7,实验结果,.,8,鸡的完整的NTE序列是4501bp组成（basepairkilo-basepairDNA碱基对数目生物学上描述DNA常用的kb、nt、bpkb=千碱基对kilobasent核苷酸nucleotidebp碱基对basepair）鸡的NTE有两个不同的区域，其中一个是推定的调节区（cNTER）,另外一个是催化区，也叫NTE酶的活性区域序列分析表明，鸡的NTE的排列与人和鼠的NTE排列有高度的相似性，其中与人有80%的相似性，与鼠有79%的相似性。,.,9,实验结果二，cNEST是有NTE活性的，而不是cNTER是用细胞转染的方法来证明的。就是用GFP来标记cNEST和cNTER的羧基端，48h的转染后，用Westernblot法来测定下她们的分子量，结果表明他们的分子量分别为65和83kDaNTE活性测定是在HEK293Tcells中看GFP的表达。,.,10,DistributionofGFPtaggedcNTERandcNESTproteininmammaliancells,因为cNTERandcNEST都用GFP来标记，所以cNTERandcNEST的分布可以用荧光显微镜直接分析出来,.,11,荧光显微镜结果,.,12,NTER和NEST分子量的测定,.,13,不同处理因素对cNTER的影响,.,14,.,15,.,16,Discussion,相对于哺乳动物的PNPLAs，鸡的PNPLAs尚未引起足够的重视。尽管成年母鸡常被用作OPIDN的动物模型。但是关于NTE的排序和分子特征知道的很少。在目前的研究中，鸡的NTE被完整的分离出来，并且在氨基酸水平与人和小鼠有高度的相似性。另外，蛋白质结构和区域与人也有高度的相似性。,.,17,AnERlikelocalizationofpcNTER-GFPwasobservedandcNTEwasreasonablyconsideredtobeanER-anchoredprotein.cNTEmaybedegradedbymacroautophagy.,.,18,.ChickenNTEwasanER-anchoredproteinAnERlikelocalizationofpcNTER-GFPwasobservedandcNTEwasreasonablyconsideredtobeanER-anchoredprotein.Therefore,cNTEmaybedegradedbymacroautophagy.,.,19,thatcNTEwasdegradedbytheproteasomeandthesimilarD-boxsequencesmayactasrecognitionsignalfordegradation.However,furtherstudiesarerequiredtodeterminewhethertheseresiduesaffectthedegradationofcNTE.,.,20,总结,Insummary,chickenNTEgenewasfirstlyidentified.BycharacterizationoftheregulatoryandesteraseactivitydomainofchickenNTE,chickenNTEwasconfirmedtobeanER-anchoredproteinandbedegradedbymacroautophagyandtheproteasomepathway.Theser