微生物发酵工程复习题

名词解释发酵：即发泡现象，指利用微生物进行生长和代谢活动，并通过现代化工技术，进行微生物代谢活动形成各种有用产品的过程。现代微生物发酵工程：将传统的发酵技术和基因工程、细胞融合工程、酶工程等新技术结合起来的生物技术，并通过现代化工技术生产传统发酵不能生产出的产品。重点研究微生物的生命及其代谢途径，以及优化控制微生物代谢的规律、方法和应用。自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。诱变育种：利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程。分批发酵：将培养基装进容器中，灭菌后接种开始发酵，周期是数小时或几天，最后排空容器，进行分离提取产品，再进行下一批发酵准备，中间除了空气进入和尾气排出，与外界没有物料交换。连续发酵：在反应器中不断补充新鲜的培养基，并不断以同样速度排出培养物，培养液的流入量等于流出量，使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，保证反应器中总菌数量基本不变的方法。补料分批发酵：在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法，又称为半连续发酵或流加分批发酵法。下游加工过程：又称发酵后处理，是指从发酵液或酶反应液中分离、纯化目的产物并加工成成品的过程。过滤：是用过滤介质将悬浮液中的固体颗粒与液体分离的过程。离心分离：让料液在离心力场作用下促使其固形颗粒加速沉降而与液体分离的过程。沉淀：在发酵液中加入沉淀剂，使待分离的生化物质形成不溶性复合物或复合盐而析出的过程。盐析：在高浓度中性盐存在下，使生物分子在水溶液中的溶解度降低而产生沉淀的方法，多用于蛋白质的分离双水相萃取：利用不同物质在双水相间分配系数不同的特性进行萃取的方法。自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。湿热灭菌法：按被灭菌物品的性质不同，选择不同温度的湿热蒸汽进行灭菌，此法在同一温度下笔干热杀菌效力大。连续灭菌：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺过程，又称连消。菌种初筛：是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛选出来的过程。初筛可分为平板筛选和摇瓶发酵筛选。菌种复筛：对初筛出来的菌种进行复筛，通常采用摇瓶培养法，一般一个菌株至少要重复35个瓶，培养后的发酵液必须采用精确分析方法测定。种子扩大培养：是指将保存在沙土管、冷冻干燥管、斜面试管等中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和高质量的纯种的过程。巴斯德消毒法：将待消毒的物品在6062加热30min或在70加热15min，以杀死其中的病原菌和一部分微生物的营养体。辐射灭菌法：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物。连续发酵：是指以一定的速度向发酵罐内连续添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长或生产。菌种活化：保藏在沙土管、冷冻干燥管或斜面中的菌种经无菌操作接入适合于孢子发芽或营养体生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子或营养体再一次接入试管斜面，反复培养几次。消沫剂：工业发酵中用于消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证生产的正常运转。空气分布器：是把无菌空气引入发酵罐中并分布均匀的装置，有单孔管、多孔环管及多孔分支环管等几种。杂交育种：一般指两个基因型不同的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。基因工程育种：是应用基因工程手段进行的，基因工程师一种DNA体外重组技术，是在分子水平上，根据需要，用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状。初级代谢产物：微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物。次级代谢：是微生物在一定的生理阶段出现的一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类利于生存的代谢类型，次级代谢产物通常是在生产后期合成。富集培养：由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要哦分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量。生物处理法：就是在发酵工业废渣水中利用各类微生物的新陈代谢功能进行物质转化的过程，使废水中呈溶解和胶状的有机物被降解并转化成为无害的物质，废渣水中的有机和一些有毒物质（如酚等）不断被转化分解或吸附沉淀，从而达到净化污水、消除公害的目的。原生质体融合：用酶法将细胞膜外侧的细胞壁除掉，制备成无细胞壁的球状细胞体即原生质体，将两种来源于微生物细胞A和B的原生质体，在融合诱导剂的存在下等量混合起来，可使原生质体表面形成电极性，相互之间容易吸引、脱水黏合而形成聚合物，进而使原生质体收缩变形，紧密接触处的膜先形成原生质桥，逐渐增大而实现融合细胞融合技术：是把两个亲本的细胞经酶法除去细胞壁得到两个球状原生质体或原生质体球，然后置于高渗溶液中，通过生物法、化学法或物理法等诱导融合法，促使两者互相凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，获得新的重组子（菌株）。这种融合又称为原生质体融合。问答题一、微生物发酵的特点：（1）发酵的催化作用都在细胞内进行（2 ）很大的比面积（表面积/体积比）（3）原料来源广，价格低廉。（4）反应条件温和，生产过程安全。（5）设备“多功能”，代谢途径多样化（6）具有易变性二、菌种保藏的基本原理？主要方法及优缺点？P37答：菌种保藏的基本原理是根据菌种的生理、生化特性，人为地创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。主要是低温、干燥、缺氧、缺营养四个条件。（1）斜面低温保藏法此方法利用4冰箱保存菌种斜面，保存期13个月。保存期间冰箱的温度不可波动太大，不能在0以下保存，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能衰退或死亡。（2）液体石蜡覆盖保藏法在斜面菌种上加入灭菌后的液体石蜡，用量高出斜面1cm，使菌种与空气隔绝，试管直立，置于4冰箱保存期1年。此法适用于不能以石蜡为碳源的菌种。（3）载体保藏法（4）悬液保藏法（5）冷冻干燥保藏法：是在低温下迅速地将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般为510年。此法适用于各种微生物。（6）液氮超低温保藏法：将浓的菌悬液加入无菌的保护剂，每个安瓿管分装210mm高度的菌悬液，立即熔封。封口后对安瓿管进行严格的检查，确保不致使液氮渗入安瓿管。以每分钟降低1的速度冷却至25左右，然后放入液氮罐。安瓿管保藏在196的液氮罐中，保藏期可达10年之久。（7）寄主保藏法三、菌种扩大培养的目的与定义P91目的：（1）接种量的需要（2）菌种的驯化（3）缩短发酵时间、保证生产水平定义：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。四、杂菌污染与防治污染原因（1）设备结构不严密，阀门太多，设备有死角，灭菌时蒸汽不到，故管道与阀门要尽可能简化（2）空气过滤不彻底，带有杂菌。（3）种子不纯带有杂菌，或在纯种培养时由于灭菌不彻底，接种时将杂菌带入发酵罐，或由于接种方法不严格造成（4）原料灭菌不彻底，其中有可能是接种原料灭菌不彻底（5）环境不卫生污染的防治：（1）防治种子带入杂菌（2）培养基彻底灭菌（3）防止空气系统染菌（4）注意环境卫生，建立卫生制度五、下游加工过程的一般流程（1）发酵液的预处理和固液分离预处理有加热、调PH、凝聚与絮凝等，固液分离有过滤、离心、膜分离、双水相萃取法、扩张床技术。（2）产物的初分离，常用方法有沉淀、萃取、膜分离、吸附和离子交换等（3）产物的高度纯化，常用方法包括各种层析法和结晶法等。（4）成品加工，包括产物干燥、除菌、除热源等。六、萃取操作的基本步骤（1）混合将料液和萃取剂充分混合成乳状液，使溶质转入萃取液。（2）分离将乳状液分成萃取相和萃余相（3）回收溶剂七、萃取法的原理、特点及其运用原理：利用不同物质在选定的溶剂中溶解度不同来分解混合物中组分的方法。优点：萃取法选择性高，分离效果好，不仅可用于产物的提取和浓缩，还可使产物得到初步纯化；通常在常温或较低温度下进行，对热敏性物质破坏小，且能耗低；还可实现多级操作，便于连续生产。应用：在抗生素等制品中的生产上有着广泛的应用。八、与分批发酵相比，连续发酵具有哪些优、缺点？答：优点：可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定。能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会。减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时。由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长。容易对过程进行优化，有效提高发酵产率。缺点：由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染。在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异。对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高。黏性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内团结，给连续发酵操作带来困难。九、简要写出通用发酵罐的主要部件及其作用答：罐体。搅拌器与挡板：搅拌器的主要作用是打碎气泡，增加气液接触界面，提高氧的传质速率；同时使发酵液充分混合，液体中的固形物保持悬浮状态。挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。空气分布器：把无菌空气引入发酵罐中并分布均匀的装置。轴封：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄露和污染杂菌。变速装置。消沫器：破碎发酵中产生的泡沫。冷却管。入孔。视镜。酵母菌原生质体融合育种的原理及操作步骤？答：原理：原生质体融合就是用酶法将细胞膜外侧的细胞壁除掉，制备成无细胞壁的球状细胞体即原生质体，将两种来源于微生物细胞A和B的原生质体，在融合诱导剂的存在下等量混合起来，可使原生质体表面形成电极性，相互之间容易吸引、脱水黏合而形成聚合物，进而使原生质体收缩变形，紧密接触处的膜先形成原生质桥，逐渐增大而实现融合。融合的原生质体在适当条件下可再生出细胞壁而形成一个新细胞。操作步骤：标记菌株的筛选和稳定性验证。酵母原生质体制备。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。涂布于再生培养基，再生出菌落。选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。发酵工程有哪些问题需要引起重视？答：底物不可能完全转化为目的产物，而且会有很多副产物的产生。由发酵工程采用的是活细胞，其产物的生成率一方面受外界环境的影响，另一方面受细胞自身的影响，所以工艺控制比较困难，生产波动比较大。发酵工程需要的辅助设备多，动力费用比较高。发酵中，以为底物浓度不能过高，导致需要使用大体积的反应器。发酵废液中具有较高的COD和BOD，排放前，必须经过处理。工业发酵对生产菌种选择有哪些要求？(工业发酵对生产菌种的一般要求是什么？)答：菌种能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和繁殖，并且生成所需的代谢产物产量要高。菌种可以在要求不高，易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需的酶活性高。所选菌种生长速度和产物生成速度应较快，发酵周期较短。根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株。选择一些不易被噬菌体感染的菌株。生产菌种要纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。工业发酵培养基的主要成分？答：碳源、氮源、水、无机盐及微量元素、生长因子等。微生物纯种分离培养条件的控制措施？答：营养成分控制控制培养基的酸碱度添加抑制剂热处理控制培养温度通气条件的控制。气升式发酵罐的主要部件及其作用？答：罐体：装发酵液。空气分布器：把无菌空气引入发酵罐中并均匀分布的装置。冷却管：引入冷却水。喷嘴：把无菌空气喷射到发酵液中。视镜：用于观察罐内情况。入孔：便于维修、清洗罐体。简要写出通用发酵罐的主要部件及其作用。答：罐体。搅拌器与挡板：搅拌器的主要作用是打碎气泡，增加气-液接触界面，提高氧的传质速率；同时使发酵液充分混合，液体中的固形物保持悬浮状态。挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。空气分布器：把无菌空气引入发酵罐中并分布均匀的装置。轴封：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄露和污染杂菌。变速装置。消沫器：破碎发酵中产生的泡沫。冷却管。入孔。视镜。酵母菌原生质体融合育种的原理及操作步骤答：原理：原生质体融合就是用酶法将细胞膜外侧的细胞壁除掉，制备成无细胞壁的球状细胞体即原生质体，将两种来源于微生物细胞A和B的原生质体，在融合诱导剂的存在下等量混合起来，可使原生质体表面形成电极性，相互之间容易吸引、脱水黏合而形成聚合物，进而使原生质体收缩变形，紧密接触处的膜先形成原生质桥，逐渐增大而实现融合。融合的原生质体在适当条件下可再生出细胞壁而形成一个新细胞。操作步骤：标记菌株的筛选和稳定性验证。酵母原生质体制备。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。涂布于再生培养基，再生出菌落。选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。发酵过程染菌的防治措施答：杜绝种子带菌。加强空气净化，防止空气带菌。消灭设备和管道的死角。防止设备渗漏。严格操作规范，减少操作失误。发酵工程的应用范围有哪些方面？答：医药工业：生产出了如抗生素、维生素、动物激素、药用氨基酸、核苷酸等。食品工业上的应用主要包括：第一、生产传统的发酵产品，如啤酒、食醋等，使产品的质量和产量得到明显提高。第二、生产食品添加剂。如柠檬酸、谷氨酸、红曲素等。第三、单细胞蛋白的生产。能源工业：通过微生物发酵或固相化细胞或酶的技术生产绿色能源；采油微生物、产氢微生物、产石油微生物的运用；微生物电池。化学工业：生物塑料；微生物发酵生产的化工原料；生物表面活性剂；生物凝集剂；生物制浆。农业：改造植物基因；生物固氮；工程杀虫菌生物农药；微生物饲料。环境保护：利用微生物可以消除对废水、废渣、废气对环境的污染；对有毒废弃物的微生物处理技术主要包括厌氧发酵法和需氧发酵法。14、造成菌种退化的主要原因答：菌种的自发突变或回复突变，引起菌体本身的自我调节和DNA的修复，有的因为完整的修复而恢复为低产菌株原型，有的因为错误的修复而产生新的负突变菌株。细胞质中控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一致，若核内DNA复制的速率超过质粒，经过多次传代繁殖，细胞中将出现不具有对产量起决定作用的质粒，造成菌种退化。基因突变是引起菌种退化的根本原因，而移接代数越多，发生突变的概率越高。不良的培养和保藏条件，容易诱发菌种基因或表型的改变，或导致质粒脱落，导致菌种退化。提高发酵产品产率的措施答：加强菌种选育，提高菌种的生产能力。不断改进发酵工艺。优选培养基配方。提高设备利用率。保存菌种的常规方法答：斜面低温保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、沙土管保藏法、悬液保藏法、真空冷冻保藏法低温保藏法和液氮超低温保藏法。斜面低温保藏法：是一种短期的保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌个霉菌的短期保藏。用新鲜试管斜面培养基接种微生物后，置于最适条件下培养并生长良好后，将试管口防水密封，然后放入4冰箱中保存。液氮超低温保藏法：将浓的菌悬液加入无菌的保护剂，每个安瓿管分装210mm高度的菌悬液，立即熔封。封口后对安瓿管进行严格的检查，确保不致使液氮渗入安瓿管。以每分钟降低1的速度冷却至25左右，然后放入液氮罐。安瓿管保藏在196液氮罐中，保藏期可达10年之久。发酵工程的特点答：发酵工程使用的原料来源广泛，多为农副产品，其中以碳源为主，只加少量有机和无机氮源，不含有毒物质。发酵工程的反应过程比较温和，通常在常温、常压下进行，而且一种设备可有多种用途。容易进行复杂的高分子化合物的生产，如酶、化学活性体等。能够高度选择性地进行复杂化合物在特定部位的反应。生产产品的微生物菌体本身也可作为发酵产物。发酵过程是纯种培养过程。在操作中要严格防止染菌。在不增加任何设备投资的情况下，通过菌种选育，改良菌种的生产性能来提高生产能力，可有达到事半功倍的效果。在发酵生产中，还可以通过改进工艺技术和设备来提高产品的产量和质量。染菌发生的时期不同对发酵的影响如何？答：种子期染菌：若在种子期染菌未及时发现，带入发酵罐中，则造成大罐倒灌。发酵前期染菌：发酵前期染菌后的杂菌与生产菌争夺营养物质，甚至分泌些代谢物干扰生产菌的正常生长、繁殖和产物的生成。发酵前期染菌极易造成整批倒灌，损失大，后果严重。发酵中期染菌：发酵中期染菌导致大量的营养物质被杂菌消耗而不能转化成产物，同时杂菌的繁殖又严重干扰了生产菌的代谢及产物的生成，有时生成产物会被杂菌利用或破坏。由于发酵后期，发酵液指的营养物质已接近耗尽，产物的积累较多，如染菌不多，可继续进行发酵。选择、填空题菌种是发酵的关键因素和灵魂纯种分离技术包括平板划线分离法、稀释分离法、涂布分离法。活菌计数的方法：梯度稀释法、比浊法、膜过滤法平板快速检测法：抑菌圈法透明圈法变色圈法生长圈法性能测定中：粗测起定性的作用，一般在培养皿上进行，精测: 起定量的作用。试验要接近生产工艺条件。粗测工作量大，精测手续繁琐。菌种选育有诱变育种、杂交育种、转化、转导、原生质体融合及基因工程技术等重要手段。发酵类型按微生物对氧气的要求分：好氧发酵、厌氧发酵、兼性厌氧发酵；按培养基状态分为固体发酵和液体发酵发酵一般的工艺过程：原料的处理灭菌、空气的净化除菌、菌种培养及扩大、发酵的条件控制、产品提取精制。噬菌体污染的防治主要是选育抗噬菌体的菌株。判断发酵设备好坏的唯一标准是是否符合工艺要求固态通风发酵设备有：自然通风固态发酵设备、机械通风固态发酵设备、连续式通风固态发酵设备去除悬浮物常用的方法：重力法、热处理法、等电点法、絮凝法。微生物工程中常用的过滤方式有加压过滤和真空过滤常用的离心设备：管式和碟片式离心机、倾析式离心机微生物细胞的破碎：物理法、化学法和生物法。物理破碎法有高压匀浆法、挤压法、高速珠磨法、超声破碎法；化学破碎法有渗透冲击法和增溶法;生物破碎法主要是酶溶法影响盐析的主要因素：盐的种类、溶质的起始浓度、溶液的pH、操作温度。影响萃取的主要因素：pH、温度、盐析作用、溶剂性质。在萃取中，被提取的溶液为料液，欲分离的物质为溶质，进行萃取的溶剂为萃取剂，经萃取分离后，大部分溶质被转移到萃取剂中，所得溶液为萃取液，被萃取出溶质后的料液为萃余液去乳化即破坏乳浊液，常用方法：过滤和离心、加热、稀释、加电解质、吸附、顶替和转型筛选菌种的步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定发酵过程的控制有：菌体浓度、基质浓度、溶氧浓度、温度、pH、CO2、泡沫。温度对发酵的影响：一是对菌体生长的影响，二是对产物合成的影响，三是对发酵液理化性质的影响。目前常用的需氧发酵罐有：机械搅拌发酵罐、气升环流发酵罐、自吸式发酵罐和鼓泡式发酵罐。菌种选育的方法主要包括：自然选育、诱变育种