基因克隆与表达ppt课件

.,蛋白原核表达,卫文强2015.12,.,目的基因-T表达载体酶切，胶回收，连接转化到克隆用细胞（Top10)提质粒，酶切验证转化到表达用细胞（BL21（DE3)）诱导表达SDS-PAGE,.,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1）.DNA的纯度,影响限制性内切酶活性的因素,2）.DNA的甲基化程度,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。,.,3）.温度,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。,是影响限制酶活性的重要因素。,4）.缓冲液(Buffer),商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。,.,用时在冰上操作；取酶用干燥、灭菌、新的枪头酶用量不能超过酶切总体积的10%；多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液；,关心小贴士告诉你,使用时注意事项：,.,连接、转化与重组子鉴定,1、连接,.,（1）必须是两条双链DNA。,（2）DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+,（2）.连接条件,.,ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装；单价离子：150-200mMNaCl，提高连接效果；PEG：5%以下可以提高连接效率,连接效果最好在37，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：12-16，较好的连接效果，互补又较稳定;,2）连接温度：,3）反应液中的成分：,.,目的或作用：,4）插入片段与载体的浓度比例,载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为13左右，甚至110或更高。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,.,化学法（CaCl2法)：,转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。,2、转化,.,影响转化率的主要影响因素:,载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；,插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；,受体细胞的类型及预处理；,转化方法：电击法高于化学法。,.,限制性酶切图谱法,3、转化子的筛选和鉴定,.,质粒DNA的提取,质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。,.,质粒DNA提取方法：,碱裂解法、煮沸法、SDS法等,碱裂解法原理：,在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。,.,抽提出质粒的构型：,1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中，超螺旋DNA占大部分。,2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA。,3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。,.,抽提出的质粒三种构型电泳结果：,.,凝胶电泳技术,电泳目的：对核酸分子进行分离和检测,.,凝胶分辨DNA的能力：,凝胶浓度:,浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳,凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小,原来如此！,.,电泳缓冲液,pH值：偏碱性，带负电荷,离子浓度：离子浓度高电流大发热快胶溶解,种类：,TAE（Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集TBE（Tris+EDTA+硼酸）:缓冲能力最强TPE（Tris+EDTA+磷酸）:缓冲能力低TNE（Tris+EDTA+醋酸钠）,.,pET表达载体,.,.,.,.,pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、DE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。,.,T7表达系统转录调控的机理化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。,T7RNA聚合酶基因,lac启动子,E.Coli（DE3）,IPTG诱导,.,BL21:lon,ompTBL21(DE3):T7polymeraseRosetta:optimalcodonsOrigami:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)Rosetta-gamiOrigamiB:(IPTGconcentrationdependent),菌株种类,.,基本原理,SDS-PAGE技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS肽链复合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电），并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子量的实验技术。,.,基本步骤,制备分离胶制备浓缩胶上样并电泳凝胶板剥离与染色脱色结果分析,.,加入分离胶溶液pH8.8,制备分离胶,封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,.,分离胶pH8.8,制备浓缩胶,.,浓缩胶pH6.8,分离胶pH8.8,上样及电泳,开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。,.,凝胶板剥离与染色,电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染