临床基因扩增检验培训班-核酸化学概论

核酸化学概论,湖北中医药大学检验学院谢圣高,内容,核酸的结构和功能DNA的生物合成RNA的生物合成,第一部分核酸的结构和功能,核酸(nucleicacid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年FridrichMiescher从脓细胞中提取“核素”1944年Avery等人证实DNA是遗传物质1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年Nirenberg发现遗传密码1975年Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA测序方法1985年Mullis发明PCR技术1990年美国启动人类基因组计划(HGP)1994年中国人类基因组计划启动2001年美、英等国完成人类基因组计划基本框架,人类基因组（Humangenome）,人类DNA分子的全序列。1986年由美国提出，1990年启动，2000年测序草图完成。3109个碱基对3104个基因。6个国家：美、德、日、英、法、中（1999年）。其中，中国测序1，第3号染色体短臂，3107个碱基对122个基因。,二、核酸的分类及分布,第一节核酸的化学组成及其一级结构TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid,一、核酸组成,A、G,U、CA、G,T、C,RNA：,DNA：,核酸的化学组成,1.元素组成C、H、O、N、P（910%）,DNA和RNA的区别,稀有碱基嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶都是基本碱基的化学修饰型,核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。,核苷酸(ribonucleotide),多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,C,G,A,二、核酸的一级结构,定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。bp:碱基对数目,书写方法,5pApCpTpGpCpT-OH3,5ACTGCT3,第二节DNA的空间结构与功能DimensionalStructureandFunctionofDNA,DNA的二级结构：双螺旋结构DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义DNA双螺旋结构模型要点DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装DNA的超螺旋结构原核生物DNA的高级结构DNA在真核生物细胞核内的组装DNA的功能,一、DNA的二级结构双螺旋结构,（一）DNA双螺旋结构的研究背景,碱基组成分析Chargaff规则：A=TGC,碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理,DNA纤维的X-线衍射图谱分析,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove)相间。,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;GC）。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,目录,碱基互补配对,T,A,G,C,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力（疏水作用力）维持双链纵向稳定性。稳定双螺旋结构的主要因素：碱基堆积力,目录,Itwasinthispub,EaglepubinCambridge,JamesWatsonandFrancisCrickannouncedtheirdiscoveryofDNAonFebruary28,1953.,2020/6/1,27,“Wehavediscoveredthesecretoflife!”,1993,（三）DNA双螺旋结构的多样性,目录,多见,三种DNA构型的比较,DNA二级结构是指DNA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构和四股螺旋结构。,DNA还有以三股螺旋DNA(triplehelix)存在，或称为三链DNA(triplestrandDNA,tsDNA),二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装,（一）DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反（多见）,意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,（三）DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。,核小体的组成DNA：约200bp组蛋白：H1H2A，H2BH3H4,（二）原核生物DNA的高级结构,环状双螺旋结构,串珠状核小体,DNA双螺旋片段,染色质纤维,伸展形染色质片段,密集形染色质片段,整个染色体,2020/6/1,38,真核生物基因组的特点,1.重复序列,单拷贝序列：只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因,中度重复序列：在DNA中可重复几十次到几千次,高度重复序列：可重复几百万次。其中，富含G-C的更靠近管底，称为卫星DNA（satelliteDNA）,2.断裂基因,2020/6/1,39,断裂基因：,mRNA,1872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段,基因中存在内含子,例外：组蛋白基因(histongene)干扰素基因(interferongene)没有内含子,三、DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,2020/6/1,41,基因基因(gene)：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。一个基因不仅仅包括编码序列，还包括调控序列及位于编码区5端上游的非编码序列、内含子和位于编码区3端下游的非编码序列，以及RNA。,2020/6/1,42,基因的分类按产物的类别按其功能结构基因：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。调节基因：指某些可调节控制结构基因表达的基因，合成阻遏蛋白和转录激活因子。其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。只转录不翻译的基因：核糖体RNA基因rDNA基因tRNA基因,蛋白质基因RNA基因,结构基因：Structuralgene调节基因：Regulatorygene,2020/6/1,43,基因组(genome)是指一种生物体具有的所有遗传信息的总和。如人类基因组包含22对染色体和X、Y两条性染色体上的全部遗传物质(核基因组)以及线粒体上的遗传物质(线粒体基因组)。基因组的结构主要指不同的基因功能区域在核酸分子中的分布和排列情况，基因组的功能是遗传信息的贮存和表达。基因组学的研究包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（即后基因组学)。,基因组,第三节RNA的结构与功能,StructureandFunctionofRNA,RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。RNA比DNA小的多。RNA的种类、大小和结构远比DNA表现出多样性。,RNA的种类、分布、功能,另外：RNA病毒，以RNA为遗传物质,一、信使RNA的结构与功能,内含子(intron),*mRNA成熟过程,外显子(exon),从AUG开始，每三个核苷酸为一组编码了一个氨基酸，称为三联体密码(codon)。成熟的mRNA由氨基酸编码区和非编码区构成。5-末端的帽子(cap)结构和3-末端的多聚A尾(poly-Atail)结构。,成熟的真核生物mRNA,*mRNA结构特点,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构,mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,*mRNA的功能把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,*mRNA上存在遗传密码,mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每3个核苷酸残基为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码（tripletcode）起始密码（initiationcoden）:AUG终止密码（terminationcoden）:UAA，UAG，UGA,*tRNA的一级结构特点含1020%稀有碱基，如DHU3末端为CCA-OH5末端大多数为G具有TC,二、转运RNA的结构与功能,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,*tRNA的二级结构三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环额外环TC环,氨基酸臂,额外环,密码子、反密码子配对的摆动现象,*tRNA的三级结构倒L形,*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,*rRNA的结构,三、核蛋白体RNA的结构与功能,*rRNA的功能是细胞内含量最多的RNA(80)。参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,*rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA,原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA,核蛋白体的组成,四、其他小分子RNA及RNA组学,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。,snmRNAs,snmRNAs的种类核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小片段干涉RNA,snmRNAs的功能参与hnRNA和rRNA的加工和转运。,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学,siRNA是生物宿主对外源侵入的基因表达的双链RNA进行切割所产生的特定长度和特定核酸序列的小片段RNA。siRNA可以与外源基因表达的mRNA相结合，并诱发这些mRNA的降解。基于此机理，人们发明了RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术。,小片段干扰RNA,核酶,脱氧核酶（deoxyribozyme）：通常是人工合成的脱氧核糖核酸，降解RNA，也降解DNA。,核酶（ribozyme）：具有催化作用的核糖核酸，降解RNA。,原核生物基因表达的特异性：无核膜，在同一空间,五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现了不同的时空特性,真核生物基因表达的特异性：不同的时间和空间,核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid,第四节,目录,核酸的酸碱及溶解度性质核酸为多元酸，具有较强的酸性。核酸的高分子性质粘度：DNARNAdsDNAssDNA沉降行为:不同构象的核酸分子的沉降的速率有很大差异，这是超速离心法提取和纯化核酸的理论基础。,2020/6/1,71,核酸在波长260nm处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。,一、核酸分子具有强烈的紫外吸收,2020/6/1,72,碱基的紫外吸收光谱,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用,二、DNA的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,增色效应(hyperchromiceffect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,DNA解链时的紫外吸收变化,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光度）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。,G+C含量越高，解链温度就越高。,解链曲线的变化,三、DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,研究DNA分子中某一种基因的位置。监定两种核酸分子间的序列相似性。检测某些专一序列在待检样品中存在与否。是基因芯片技术的基础。,核酸分子杂交的应用,第五节核酸酶Nuclease,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DNA。RNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA。依据切割部位不同核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。,参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,核酸酶的功能,第二部分,DNA的生物合成,复制(replication)由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。,第一节复制的基本规律,一、半保留复制(semi-conservativereplication)二、双向复制（bidirectionalreplication）三、半不连续复制（semi-discontinuousreplication）四、复制的高保真性（highfidelity）,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,一、半保留复制（semi-conservativereplication),半保留复制的意义,1、使亲代DNA所含的信息以极高的准确度传递给子代DNA分子。2、DNA通过复制和基因表达这两种主要功能，决定了生物的特性和类型并体现了遗传过程的相对保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、双向复制,（一）双向复制的定义复制时，DNA从起始点（origin，ori）向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制（bidirectionalreplication）。最后到终止点(termination,ter)。,（二）原核生物的双向复制,（三）真核生物的双向复制,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,多复制子的复制,三、复制的半不连续性,DNA双螺旋的两条链是反平行的，而DNA合成的方向只能是53。在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，叫作前导链（leadingstrand）；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段（冈崎片段、岡崎片段，Okazakifragment）合成，称之为滞后链（laggingstrand）。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续复制。,领头链(leadingstrand),随从链(laggingstrand),半不连续复制,四、复制的高保真性,DNA复制的精确度极高，误差率很低，以保证物种在维持遗传保守性的同时，还要通过变异不断进化。DNA复制的高度忠实性至少要依赖三种机制：1、遵守严格的碱基配对规律；2、DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3、复制出错时，DNA聚合酶的即时校读功能。,第二节DNA复制的酶学,一、复制的化学反应（一）复制的反应体系1底物：四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP2聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶，DNA-pol；3模板：指解开成单链的DNA母链；4引物：提供3OH末端，使dNP可以依次聚合；5其他酶和蛋白质因子。,（二）复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,二、参与复制的主要酶类,（一）解旋解链酶（二）引物酶（三）DNA聚合酶（四）DNA连接酶,2020/6/1,103,（一）解旋、解链酶类复制时，解开、理顺DNA双链，并维持DNA分子处于单链状态1.拓朴异构酶（Topo）2.解链酶3.DNA结合蛋白（单链结合蛋白，SSB）,2020/6/1,104,1DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）,作用：解开或松弛DNA的超螺旋结构分类：拓扑酶异构和拓扑异构酶特点：对DNA分子的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。DNA分子一边解链，一边复制，拓扑酶是在复制全过程中都是有作用的。,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,解链酶（DNAhelicase）(DnaB蛋白)在ori部位，解开双链间的氢键，形成两股单链此过程需：DnaA（辨认起始点）DnaB（解开DNA双链、需ATP）协同作用DnaC（运送和协同DnaB）,DnaB蛋白，又称解螺旋酶,3单链DNA结合蛋白,单链DNA结合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。特点：不断脱离，又不断与新解开的单链结合,（二）引物酶（primase）1.引物酶：复制起始时催化生成RNA引物的酶2.DnaB、DnaC、引物酶等形成引发体3.合成RNA引物（引物RNA3-OH末端是DNA合成的起始点）,（三）DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DDDP）缩写：DNApol活性：1.53的聚合活性，决定复制方向2.35核酸外切酶活性，识别、切除、纠正错误碱基,1原核生物的DNA聚合酶,DNA-polIDNA-polIIDNA-pol,E.Coli中的DNA聚合酶,2.真核生物的DNA聚合酶,（四）DNA连接酶（DNAligase）,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链的5P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。特点：连接酶连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA单链的作用。功能：在复制中起最后接合缺口的作用，在DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用，也是基因工程的重要工具酶之一。,第三节DNA生物合成过程,一、原核生物DNA生物合成,（一）复制的起始（二）复制的延长（三）复制的终止,一、原核生物DNA复制的过程,起始阶段延长阶段终止阶段,initiation,elongation,termination,复制延长简图,1、DNA双链解开形成复制叉2、引发体的形成并合成引物3、超螺旋的转型,（一）复制的起始,DnaA,DnaB、DnaC,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引发体的形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,超螺旋的转型,解链将导致下游发生打结现象或DNA超螺旋的其他部分过度拧转。拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现DNA超螺旋的转型，即把正超螺旋变为负螺旋。实验证明，负超螺旋比正超螺旋有更好的模板作用。,（二）复制的延长,脱氧单核苷酸逐个加入而延长DNA新链，其化学反应本质是生成磷酸二酯键。催化此反应的酶：原核生物：DNA-pol真核生物：DNA-pol催化不连续复制DNA-pol催化连续复制,岡崎片段,随从链不连续复制的片段称为岡崎片段(Okazakifragment)，其大小在10002000个核苷酸。每一个不连续复制的片段5-端都带有一个RNA引物。片段的复制完成后，RNA引物会被除去而代之以DNA片段，因此复制至最后，两股子链都是DNA链。,岡崎片段,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,岡崎片段,随从链上不连续性片段的连接,（三）复制的终止,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。复制的起始点和终止点刚好把环状DNA分为两个半圆，两个方向各进行180，同时在终止点汇合。为了定位方便，习惯把E.coli的DNA分为100等分。E.coli复制起始点oriC在82位点，复制终点ter（termination）在32位点。,ter,oriC,E.Coli基因图,3,3,5,5,领头链,随从链,解链方向,聚合酶,引物酶,引物,SSB,冈崎片段,连接酶,解链酶,拓扑异构酶,DNA复制过程（总结示意图）,5,3,聚合酶（切除引物，填补空隙）,引发体,哺乳动物的细胞周期,DNA合成(synthesis)期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,（一）复制的起始,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,（三）复制的终止,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,5,结构特点,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。,端粒酶(telomerase)的组成,端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT),Furtherpolymerization,端粒酶合成端粒的爬行模式,端粒和端粒酶的生物学意义,端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关1）端粒酶活性提高端粒序列延长遗传信息稳定性增高2）活化端粒酶端粒DNA序列延长细胞分裂旺盛细胞寿命延长3）抑制端粒酶活性可以限制转化细胞生长抑制肿瘤的形成,逆转录ReverseTranscription,第四节,逆转录酶(reversetranscriptase),逆转录,一、逆转录病毒和逆转录酶,整合到宿主细胞染色体DNA中、表达病毒蛋白,大多数致癌病毒是RNA病毒人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）是一类逆转录病毒,逆转录过程,RNA模板,逆转录酶,DNA-RNA杂化双链,RNA酶,单链DNA,逆转录酶,双链DNA,碱水解,TTTT,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,二、试管内合成cDNA,三、逆转录酶和逆转录现象的生物学意义,（一）应用逆转录酶（cDNA法)，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一。（二）制备多肽类产品。如用cDNA整合到E.coli中表达IL-2产品。（三）对逆转录病毒的研究，拓宽了病毒致癌理论。,第五节DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair,一、突变的定义二、突变的意义三、引发突变的因素四、突变的分子改变类型五、DNA损伤的修复,一、突变的定义,个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段DNA在构成、复制或表型功能上的异常变化，称为突变（Mutation），也称为DNA损伤（DNAdamage）。遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。,二、突变的意义,（）突变是进化、分化的分子基础自发突变或自然突变（二）突变导致基因型改变多态性：个体之间的基因型差别。（三）突变导致死亡突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可导致个体、细胞的死亡。（四）突变是某些疾病的发病基础有害的突变,三、引发突变的因素,（一）自发突变（二）诱发突变1物理因素：主要指紫外线和各种辐射，如紫外线可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。2化学因素：化工原料、化工产品和副产品，各种工业的排放物、农药、食品防腐剂或添加剂，以至汽车排放的废气。,嘧啶二聚体的形成与解聚,四、突变分子改变的类型,（一）错配（mismatch）,DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。点突变发生在基因的编码区域，可导致氨基酸的改变。1.转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。2.颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,上：模板链下：编码链,（二）缺失、插入和框移突变,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变：三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。,缺失引起框移突变,（三）重排（rearrangement）,DNA分子内发生较大片段的交换，称为重组或重排。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、DNA损伤的修复（DNArepairing）,修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补救机制。修复的主要类型：（一）光修复(lightrepairing)（二）切除修复(excisionrepairing)（三）重组修复(recombinationrepairing)（四）SOS修复,第三部分RNA的生物合成,（转录,Transcription）,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。DNA的遗传信息传递给RNA的过程。,转录,复制和转录的共同点:,DNA模板依赖DNA的聚合酶碱基配对规律生成磷酸二酯键链延长方向53,复制和转录的区别,基因组DNA全长复制部分基因发生转录,模板和酶TemplatesandEnzymes,第一节,3CGTCATGTACAG5模板链5GCAGTACATGTC3编码链(书写结构基因)转录5GCAGUACAUGUC3mRNA翻译NAlaValHisValC多肽链模板链(templatestrand)：有意义链或Watson链,DNA双链中，能按碱基配对规律指引转录的一股单链。编码链(codingstrand)：反义链或Crick链,DNA双链中碱基序列与RNA一致的一股链。,一、转录模板,反义核酸：包括反义RNA（antisenseRNA）和反义DNA(antisenseDNA)两种，是指与靶RNA（多为mRNA）具有互补序列的RNA或DNA分子。序列与模板链一致，能抑制mRNA表达。,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录(asymmetrictranscription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录。模板链并非永远在同一条单链上。,二、RNA聚合酶,定义：以DNA为模板，催化三磷酸核苷（NTP）聚合形成RNA的酶。作用特点：DNA为模板不需引物，两游离NTP或一游离NTP与RNA链聚合.3-OH与5-P聚合形成磷酸二酯键。方向：53。,（一）原核生物的RNA聚合酶,核心酶(coreenzyme),全酶(holoenzyme),核心酶:转录延长;全酶：转录起始。70是辨认典型转录起始点的蛋白质。32是辨认热休克蛋白(Hsp)转录起始点的蛋白质。,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,（二）真核生物的RNA聚合酶,45S-rRNA，5S-rRNA(核仁)：核糖体RNA成分。hnRNA(核质)：mRNA的前体。snRNA(核质)：参与mRNA剪切。,三、模板与酶的辨认、结合,操纵子(operon)：转录是不连续的，分区段的，原核生物的一个转录单位，视为一个操纵子。包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,启动子(promoter):RNA聚合酶结合模板DNA的部位，在调控序列中。,研究启动子：RNA聚合酶保护法,目录,启动序列,在DNA模板上能被RNA聚合酶特异结合，促使转录起始的部位称为启动序列或称启动子。开始转录的第一个碱基定为-+1左侧的上游碱基定为-负值右侧的下游碱基定为-正值,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,(Pribnowbox),TATAATPuATATTAPy,-10区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognitionsite),原核生物启动子结构特点：一致性序列(concensus保守序列)：碱基序列相对稳定，不易发生突变。TTGACA：-35区，RNA聚合酶的辨认位点，结合疏松，是亚基结合位点。TATAAT：-10区，Pribrow盒，RNA聚合酶的稳定结合位点。亚基的结合位点。,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,四、终止因子（terminationfactor）因子（rhofactor）-协助RNA聚合酶辨认终止区并终止转录,转录过程TheProcessofTranscription,第二节,原核生物的转录过程,（一）转录起始,转录起始需解决三个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。转录起始复合物形成。,辨认起始位点：亚基辨认启动子的35区，RNA聚合酶全酶(2)与模板疏松结合。酶滑行到10区，通过亚基与模板牢固结合。2.DNA双链解开:RNA聚合酶挤入DNA双链中，解链长度约20个核苷酸，拓扑异构酶参与。,转录起始过程：,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。,RNApol(2)-DNA-5pppGpN-OH3,转录起始复合物:RNA聚合酶-DNA模板-四磷酸二核苷酸,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,3.转录空泡的形成：,目录,DNA/DNA双链比DNA/RNA杂化双链稳定稳定性:GCA=TA=UDNA双链超螺旋作用,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象：边转录边翻译,核糖体,RNA,RNA聚合酶,依赖Rho()因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,RNA聚合酶在DNA模板上停止前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落。,机制,ATP,依赖Rho因子的转录终止：具有控制转录终止作用的蛋白质因子。机制：Rho因子与RNA3-OH的polyC结合，抑制聚合酶活性，激活解螺旋活性。,2.非依赖Rho因子的转录终止,DNA模板近终止处，有特殊的碱基序列，转录出RNA产物形成特殊的结构终止转录。发夹或茎环结构：局部二级结构末端PolyU：U:A不稳定.,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹