放射性点标记的多肽Arg-Arg-Leu在靶向新血管的生成和肿瘤细胞分子显像中的应用

孙鹏飞,放射性点标记的多肽Arg-Arg-Leu在靶向新血管的生成和肿瘤细胞分子显像中的应用,实体瘤主要由癌细胞和肿瘤血管组成，血管的新生在肿瘤细胞的代谢和转移密切相关。临床中需要敏感的特异性强的肿瘤分子成像试剂。Brown等发现九肽序列Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys能够与肿瘤原性内皮细胞特异性结合。,背景,目的,对靶向癌细胞和肿瘤原性内皮细胞（TDECs）的多肽显像剂tRRL进行探索。初步研究tRRL与VEGFR-2的关系。,实验方法与结果,131I标记tRRL体外131I-tRRL与细胞的结合实验不同细胞对FITC-tRRL摄取131I-tRRL体内分布实验131I-tRRL标记的肿瘤SPECT成像不同细胞VEGFR-2mRNA表达量检测不同细胞VEGFR-2表达量检测FITC-tRRL对肿瘤着色VEGFR-2表达与关系,FITC：异硫氰酸荧光素,SPECT:单光子发射断层成像技术,131I-tRRL合成,合成十肽（Tyr）-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys以氯胺-T为氧化剂，用37MBq131INa与50gtRRL反应2min。磷酸缓冲液稀释，葡聚糖凝胶过滤纯化。,图-1：凝胶过滤洗脱曲线,图-2：凝胶过滤物质280nm紫外吸收曲线,tRRL标记率为60%5%;纯化后131I-tRRL纯度95%;比活度为1850kBq/mg,体外131I-tRRL细胞结合实验,将24孔细胞培养板上培养的HUVECs、B12、HepG2、HK-2（5104/well）用SF-培养基饥饿培养16h。放入含131I-tRRL的培养基中培养。分别在0.5、1、2、4、6、24h收获细胞检测放射活性（-wellcounter）。摄取率=摄取131I-tRRL细胞数目/总细胞数目,HUVECs：人脐静脉内皮细胞；B12：鼠黑素瘤细胞；HepG2：人肝癌细胞；HK-2：永生近曲小管上皮细胞,不同细胞对FITC-tRRL摄取,HUVECs、B12、HK-2用SF-培养基饥饿培养16h。放入含FITC-tRRL的培养基中培养。分别在6、24h收获细胞，用PBS重新悬浮细胞（2104/ml）检测荧光度（FlowCytometer）。,FITC：异硫氰酸荧光素,131I-tRRL体内分布实验,在裸鼠左前肢注入1107B16。待肿瘤直径为0.8cm时，通过尾静脉注射37kBq131I-tRRL200l。24h后，脱颈椎处死，对头、肺、肝、胃、小肠、脾、骨髓、肾骨骼肌和肿瘤称重。NaI井型检测器检测各部位放射性活度。最终实验结果用每克部位131I-tRRL含量与总注入剂量的百分比计算,SPECT成像,在两组裸鼠左前肢分别注入1107B16和HepG2。待肿瘤直径为0.8cm后，服用高氯酸钠抑制甲状腺。通过尾静脉注射7.4MBq131I-tRRL200l。24h后，相机成像。,不同细胞VEGFR-2mRNA表达量检测,Trizol提取SKOV3、HAECs、EOMAs(5104/ml)的所有RNAs。以GAPDHmRNA为参照，用RT-PCR检测VEGFR-2mRNA的表达量。,SKOV3：人卵巢癌细胞；HAECs：人大动脉内皮细胞；EOMAs：鼠内皮瘤细胞,不同细胞VEGFR-2表达量检测,用RIPA裂解液提取SKOV3、HAECs、EOMAs、THP-1、HUVECs所有蛋白质。SDS-PAGA分离，以胞内GAPDH为参照，WesternBlot分析检测VEGFR-2表达量。,FITC-tRRL对肿瘤着色VEGFR-2表达与关系,用含FITC-tRRL的培养基培养培养HUVEC、EOMA、SKOV3。,结论,tRRL能够特异性的识别一些肿瘤细胞（如：