放射免疫技术课件

第六章放射免疫技术,第一节放射免疫技术一、原理及分类二、常用的放射性核素三、标记物制备及鉴定四、抗血清鉴定,第二节放射免疫分析一、基本原理二、实验方法及测定第三节免疫放射分析一、基本原理二、IRMA与RIA的比较,思考题小结,免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。,标记免疫技术基本概念,常见标记免疫技术,放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术,第一节放射免疫技术,早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。,放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。,免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。,放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA,其它,一、放射免疫技术原理及分类,二、放射免疫技术常用的放射性核素,放射性核素是指在自然条件下可发生自发性的转化，由一种放射性核素转变为另一种放射性核素，并同时释放射线，放射性核素的这一转变过程称为放射性衰变。依衰变方式不同分为、三类。,二、放射免疫技术常用的放射性核素,125I3H射线理化性活泼差核素丰度90%半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂,常用标记核素,125碘-标记物的制备标记,125I-,化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。,125I或125I+,125I-标记物（混合物）,Ch-T、LPO氧化,取代反应,直接标记法,三、放射免疫技术标记物制备及鉴定,使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积200l反应时间1-2分钟弱碱性反应条件（7.4-7.6）,间接标记法,联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。,bolton-Hunter,125碘-标记物的制备纯化,凝胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱法,聚合、损伤物,标记蛋白,游离125I,125碘-标记物的制备鉴定,标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性,放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%,免疫活性标记物与抗原或抗体反应的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好（应大于80%）,比放射活性单位质量标记物中所含的放射性强度。每分子抗原平均所结合放射性原子数目。单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，将影响标记物免疫活性,计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性,结果准，测定复杂,比放射性计算法,结果欠准，计算简便,自身置换曲线反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少,标准曲线反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准品抗原组成标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少,通过比较标记抗原与标准品抗原的免疫活性来测定标记物的比放射活性。,比放射性自身置换法,标准曲线与自身置换曲线平行表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合的抗原物质总量相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml)计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量(ng/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng),125碘-标记物的制备鉴定,标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性,四、放射免疫技术抗血清鉴定,抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示。单位为稀度单位（LM-1）Ka值高（10912L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度,亲和性,亲合力高,亲合力低,放射免疫技术抗血清鉴定,特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50%时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性,特异性,效价,五、方法学评价,除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性剂量-反应曲线高剂量钩状效应,第二节放射免疫分析,放射免疫分析RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。,一、放射免疫分析基本原理,竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力,Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。,以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(BF)与Ag的量变存在着函数关系剂量反应曲线,注：T即是B与F的总和,二、放射免疫分析实验方法及测定,抗原抗体反应,Ag*,Ag,反应条件体积温度时间pH,Ab,(标准Ag/样品Ag),平衡非平衡一步法二步法,实验过程包括：抗原抗体反应、分离结合标记物、放射性测定和数据处理等。,分离结合、游离标记物,二抗体沉淀法,PEG沉淀法,PR试剂法,活性炭吸附法,分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济,只有将B和F分离，并测定其中一个组分（一般测量结合标记物），才能得到剂量反应曲线。,测量、数据处理,晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm),计算,参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%),拟合,注：T即是B与F的总和,定量的依据是用已知浓度的标准品抗原与测量的结合标记物的放射强度之间的函数关系。,第三节免疫放射分析,一、免疫放射分析基本原理,以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。,单位点IRMA,先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量,双位点IRMA,先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。,与放射免疫分析不同，免疫放射分析采用固相吸附分离方法。免疫放射技术一般以塑料（聚苯乙烯）试管作为反应容器和固相吸附材料。聚苯乙烯能够吸附蛋白质（抗原或抗体）并保留原有结合抗原特性。当吸附特异性抗体与抗原发生反应时于固相材料表面形成复合物，未结合物质存在于液相中，将反应液弃掉并洗涤即可达到分离目的。具有操作简便、省时、无需离心步骤等优点。,分离结合、游离标记物,对于双抗体夹心法，用已知浓度系列标准品抗原进行反应，以标准品抗原浓度为横坐标，结合部分（B）放射性计数为纵坐标，获得正向剂量反应曲线。,测量、数据处理,二、IRMA与RIA比较,放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。,放射免疫分析技术的应用,1.放射免疫技术的核心是什么？2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.评价125I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？9.闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？,思考题,放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、精确性与