细胞生物学实验技术.ppt

细胞生物学实验技术，主讲人：贡曼基础医学院研究中心高格曼，本章内容摘要，第一节显微镜第二节生化和分子生物学技术第三节细胞分离技术第四节细胞培养和细胞杂交，第一节显微镜，光学显微镜和电子显微镜，-，光学显微镜，(a)普通光学显微镜，配置：照明系统光学放大系统机械装置2。原理：通过物镜形成倒置的真实图像，通过目镜放大为虚拟图像。structureofmicroscope、lightpathwayofmicroscope、3。分辨率：指示区分对象最小间距的功能。光学显微镜的分辨率r=0.61 /n.a .其中是入射光波长。N.A .镜像口速度=nsian/2；N=介质折射率；=镜子嘴(物镜端口的示例角度)。显微镜的一些光学特性：介质的折射率越接近透镜玻璃(1.7)，越好；Sin/2的最大值小于1。镜像口速度约为1.6。普通光线的波长为400到700nm，光镜分辨率约为0.2m，人眼的分辨率为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。(b)荧光显微镜Fluorescencemicroscope，特征：光源为短波光；有两个特殊过滤器。照明方法通常是自由落体表达式。fluorescent image，dnainbluandmicrotubulesingreen用于观察引起荧光的结构。用途：免疫荧光观察，基因定位，疾病诊断。(c)使用激光共焦扫描显微镜laserconfocusnningmicroscope、LCSM、激光作为照明，进行逐点、逐行、逐面的高速扫描；可以显示细胞样本的三维结构。分辨率是普通光学显微镜的3倍。用途类似于荧光显微镜，但可以扫描不同的水平来制作立体图像。LCSM、lcsmimageofaxenopusmelastohoremicrotuleocytoskeeton(green)和the nucleus (blue)，(4)深色视野显微镜dark fiels以比普通显微镜高50倍的分辨率观察4200nm微粒子。(5)相位差显微镜是通过标本的可见光的景象，将差异变更为振幅的差异，提高各种结构之间的对比度，使各种结构清晰可见。结构上相位差显微镜有两个不同于普通光显微镜的特点。环形隔膜：在光源和电容器之间。相位板：物镜添加了涂有氟化镁的相位板，可以将直射光或衍射光的相位延迟到1/4 。原理，用途：观察未染色幻灯片标本。(6)极化显微镜下polarizingmicroscope检测纤维丝、纺锤、胶原、染色体等双折射物质。进入显微镜的光是偏振，镜管有偏振器(垂直于偏振器方向的偏振板)。装载空间可以旋转。淀粉，(7)微分干涉差显微镜differentialinterpencecontrastricroscope(DIC)，1952年Nomarski设计了利用两组平面偏振光的干涉来增强图像的明暗效果，显示结构的三维投影。标本可能稍厚，折射率差异更大，所以图像的立体感更强。(8)倒置显微镜逆显微镜、物镜和照明系统反转；用来观察培养的活细胞通常有差异或DIC物镜，也有荧光装置。(9)现代显微镜的发展趋势，结合一般光学显微镜、差异、荧光、暗视野、DIC、摄影装置；自动化和电子。第二，电子显微镜，(a)透射电子显微镜透射显微显微镜，tem，1。原理，电子束作为光源，电磁场作为透镜。电子束波长与加速度电压(通常为50120KV)的平方根成反比。包括电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5个部分；分辨率0.2纳米，最高放大100万倍；用于观察微结构(小于0.2米)。表2，其他光的波长，temlightpathway，transmission electric microscope，TEM，2。样品制备技术，1)超薄切片超薄切片厚度约50纳米，采用超薄切片器制作。通常是锇酸和戊二醛固定样品，丙酮分步脱水，环氧嵌入，热膨胀或螺旋推进的方式分割，重金属(铀，铅)盐染色。2)负染色技术，用磷钨酸等重金属盐染色；吸干染料后，在样品凹处铺上一层重金属盐，凸起的地方没有染料沉积，出现负染色效果，分辨率可能达到1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria，(2)扫描电镜，20世纪60年代出来观察标本表面结构；扫描电子显微镜的有效比例为0.2mm/10nm=20000X，因为分辨率为6至10nm，人眼分辨率(分辨荧光屏幕上最近的两个光点的能力)为0.2mm。Scanningelectronmicroscope(SEM)，工作原理：用非常细微的电子束扫描样品，在样品表面产生二次电子，二次电子的量与样品表面结构有关，二次电子由探测器收集，信号放大以调制荧光屏电子束的强度，显示与电子束同步的扫描图像。为了使二次电子在标本表面发射，标本被固定并脱水后，重金属被电子束轰击，发出二次电子信号的重金属膜喷射一层。SEMLIGHTPATHWAY(人类红细胞)、酵母、iii、micromanipulationtechnique(显微解剖学)是用显微镜操纵细胞或早期胚胎的方法之一。其中包括核移植、微注射、嵌合技术、胚胎移植、微切割等。核移植技术有几十年的历史。1952年，Briggs、King等将青蛙胚胎核注入细胞核的青蛙卵中，构建了核移植胚胎。高唐(1962年)证明了原生胚胎后的核移植可以发展成成体。1997年，Wilmut等人克隆了杨多莉。微机械手，转基因微工艺，第二节生化和分子生物学技术，第一节细胞化学技术，组织化学和细胞化学染色方法用于对特定细胞成分进行定性和定位研究。(a)固定物理固定：血液膜空气干燥、冷冻干燥。化学固定：甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛、锇酸等试剂。多糖一般使用乙醇固定，表明酶多使用甲醛丙酮缓冲液固定。(b)显示方法，金属沉淀法：磷酸水解酶分解磷酸基质后，反应产物最终生成CoS或PbS着色沉淀，并显示酶活性。席夫反应：阿尔多能在席夫试剂中把无色紫红色变成红色。用来标记糖和脱氧核糖核酸(Feulgen反应)。联苯胺反应：H202的过氧化物分解。将无色苯胺氧化为联苯胺蓝，产生了转化为褐色化合物的新氧气。脂质溶解染色：用苏丹染料溶于脂质，使脂质明显。茚三酮反应：显示蛋白质。第二，免疫细胞化学免疫细胞化学免疫系统是利用抗体与特定抗原特异性结合的原理确定抗原位置的技术。常用的标记是路西法和酶。免疫荧光法：isothiocyanate fluorescein、rhodamine等。酶免疫测定法：如辣根过氧化物酶。第三，用于研究身体、组织和细胞中标记化合物的分布、定位、排放和合成、更新、作用机制、作用部位等的辐射磁显影。原则：将标记为放射性同位素的化合物引入生物体内，经过一定时间后制作切片，卤化银乳胶，使其暴露在放射性中，使乳胶感光。通常表示为14C和3H。DNA是3H-TDR，RNA显示为3H-UDR。用3小时氨基酸研究蛋白质，用3小时甘露糖，3小时岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。第四，具有分子杂交技术、互补核苷酸序列的两个单链核苷酸分子片段在适当条件下通过氢键形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA杂交双链分子。该技术可用于测定单链分子核苷酸序列之间的互补关系。(a) insituhybridization。在染色体上检测特殊的DNA序列。起初使用放射性DNA探针，后来发明了免疫探针方法。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片，(2)南方杂交是体外分析特定DNA序列的方法，用限制性内切酶将细胞核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，通过凝胶电泳分离，转移到醋酸纤维膜，通过探针进行杂交将RNA传输到胶片并通过探针杂交称为Northern hybrid。六、PCR技术，PCR: polymerasechainreaction。反应系统：样品DNA；引物，约15-20个核苷酸；4种dNTP；来自热热水杆菌Thermusaquaticus的TagDNA聚合酶。最佳作用温度为75 80 ，短时间不丧失95 的活性。缓冲系统和Mg2。反应过程：变性：约90-95；复性：约60；延长：70-75；重复变性里折叠扩大过程20-30次。三节细胞分离技术，1，离心技术是细胞器官及各种大分子分离的基本手段。转速10-25 kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89Kg称为超速离心机。超速离心机的最大速度达到10000 r/min，离心力超过500公斤。(a)差分离心Differentialcentrifugation，特征：介质密度均相同；速度从低到高，离心。用途：分离差异很大的细胞和细胞器官。沉淀顺序：核线粒体溶酶体和过氧化物酶体细胞内质网和高基质核蛋白体。可以初步分离小器官，经常需要通过密度梯进一步分离和纯化离心力。低速度，高速度，差异中心，(2)密度梯度离心，在通过离心力、离心力场分层、分离、分离细胞和细胞成分的离心管内，使用介质顶部的细胞悬浮，形成连续或不连续的密度梯度类型：速度结算，等密度结算。常用介质：氯化铯、蔗糖、蔗糖多聚。分离活细胞的介质要求：1)可以生成密度梯度，密度高的话粘度不高。2)PH中性或中性；3)浓度大时渗透压力不大。4)对细胞无毒。第二，流式细胞术，用途：单个细胞快速定量分析和分类技术。原理：包裹在外皮中的细胞通过由高频振动控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射和荧光，由探测器检测，转换为电信号，发送到计算机处理，输出统计结果，根据这些特性选择纯度可高达99%的细胞子集。胞接细胞的流动称为鞘液体，使用的仪器称为流式细胞系。第三，细胞电泳，原理：细胞表面在一定PH值下有净正电荷或负电荷，可以在外部电场作用下游动。由于各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞的充电量不同，在一定的电场内游泳速度也不同。用途：检测细胞的生理状态，分离出不同种类的细胞。四节细胞培养和细胞杂交，1，细胞培养，(1)动物细胞培养，集体培养：将包含一定数量细胞的悬浮液放入培养瓶中，使细胞附着在墙上生长，合流后形成均匀的单细胞层。Clonalculture:培养高度稀释的细胞悬浮，细胞附着生长，每个细胞形成一个细胞聚集，这称为克隆。组培养(左)和克隆培养(右)，原代培养(primaryculture):即培养出动物体内的细胞群。将细胞移植到新容器中，称为通过或通过培养，每一代分裂约3-6次。细胞株：原代培养细胞的成功传代是细胞株。细胞株：一组有特定特性或标记的细胞，从培养细胞中筛选出来。克隆：也称为克隆。是指同一祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。，表3，实验室中常用的多个细胞株，Henrietta lacks，American black，dieddofcancerofulinecervixin 1951，ii，细胞融合，培养和介导，两个或多个细胞一个双核或多核同核体：同基因型细胞融合而成。双核体：细胞融合的不同基因型。自发融合：同种细胞在培养过程中