分子生物学笔记

排版：尉志军基础分子生物学笔记主讲：姜寒玉 教材：基础分子生物学教程 作 者:赵亚华出版社: 科学出版社目录第1章 绪论1第2章 细胞内生物分子相互作用概述2第3章 核酸的结构与功能3第4章 基因与基因组的结构与功能6第5章 DNA复制8第6章 DNA的损伤、修复和基因突变11第7章 DNA重组与转座13第8章 RNA的转录合成16第9章 RNA转录后的剪切与加工20第10章 遗传密码24第11章 蛋白质的生物合成翻译26第12章 原核生物的基因调控31第13章 真核生物基因表达调控35第一章 绪论一、分子生物学发展简述1、 细胞学说的确立细胞学说的建立（The cell theory） 德国植物学家施莱登 （ Schleiden ）和德国动物学家施旺（Schwann）共同提出著名的“细胞学说”。遗传因子在生物性状世代间传递遵循分离和独立分配两个基本规律。2、 1702 Leeuwenhoek（荷兰） 3、 自制显微镜观察到雨水中的“微生物”4、 同时代的Hooke 用“细胞”来形容软木的最基本单元5、 分子生物学发展过程大致分为三个阶段：（1）准备和酝酿阶段：人类对DNA和遗传信息传递的认识阶段确定DNA是遗传物质是分子生物学发展的重大里程碑，DNA双螺旋结构模型的建立是分子生物学发展的又一重大里程碑（分子生物学诞生的标志）广义的分子生物学：蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能的 研究都属于分子生物学的范畴，即从分子水平阐明生命现象和生物学规律狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控等过程，当然也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究基因的分子生物学（核酸生物学）Molecular Biology（2）现代分子生物学的建立和发展阶段：重组DNA技术的建立和发展（3）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段：重组DNA技术的应用和分子生物学的迅猛发展阶段综合分子生物学发展历程：20世纪以核酸为研究核心，带动分子生物学向纵深发展。20世纪50年代的双螺旋结构，60年代的操纵子学说，70年代的DNA重组，80年代的PCR技术，90年代的DNA测序都是分子生物学发展的里程碑，将生命科学带向一个由宏观到微观，再到宏观的过程。6、分子生物学概念： Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. Molecular Biology-Robert F. Weaver (Version 2) 分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。第2章 细胞内生物分子相互作用概述1、生物大分子蛋白质氨基酸核酸核苷酸多糖单糖脂类单脂无论是原核生物还是真核生物，对一个生命个体来讲，均由蛋白质、核酸、糖类、脂类等生物大分子和一些小分子化合物及无机盐等这些化学成分共同组成。2、生物大分子的功能：生物体是由生物大分子等有机物构成的；/生物体能与环境不断地交换物质与能量；所有生物大分子共同存在于细胞环境中；生物体能进行自我更新。第1节 生物大分子概述1、核酸：是核苷酸的多聚体（1）DNA（脱氧核糖核酸）：由脱氧核糖、碱基（A、G、C、T）、磷酸形成的5-脱氧核苷酸构成./（2）RNA（核糖核酸）：由核糖、碱基（A、G、C、U）、磷酸形成的5-核苷酸构成。在DNA和RNA分子中，核苷酸之间以3，5-磷酸二酯键连接形成长链大分子。核酸分子都有游离的5端和游离3端。（3）磷酸二酯键：一个核苷酸的5 -磷酸和另一个核苷酸的3-OH形成磷酸酯键而共价连接（4）基本结构双螺旋结构（基本要点）： A：大沟，小沟；B：碱基配对：A=T，G= C；C：反向平行：暗示DNA复制和转录的分子机制（5）高级结构： 单核苷酸形成的二级结构：发夹结构；反向重复序列（回文序列）2、蛋白质：是氨基酸以肽键连接而成的聚合体一级结构 氨基酸的a-羧基与下一个氨基酸a-氨基缩合形成肽键，从N-端到C-端的氨基酸顺序即为多肽的一级结构。二级结构 CN键具有部分双键性质，使得C=O与N=H四原子形成刚性的肽键单元平面，肽键单元间以氢键相连，多肽链在空间折叠形成二级结构，常见的有a-螺旋和-折叠。三级结构 二级结构进一步折叠形成多肽的三级结构。亲水基团位于蛋白质外侧，疏水基团埋在内侧，氢键、盐键、范德华力和疏水力维持结构的稳定。分子伴侣帮助蛋白质正确折叠。四级结构 由多条多肽链（亚基）构成的寡聚蛋白，稳定三级结构的力量可将亚基维系在一起构成蛋白质的四级结构。3、多糖：（是由多个单糖分子缩合而成的）是糖或糖的衍生物的多聚体，许多碳原子之间产生共价键所形成的糖单位与两个以上的其他糖单位连接在一起形成大分子。4、脂类：是一大类化学结构上不同的物质，如脂肪、脂肪酸、磷脂、鞘磷脂和胆固醇等，但他们都具有不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等脂溶性的共同特征。5、生物大分子间相互作用的化学力生物大分子的基本结构通过共价键聚合而成，而其生物学功能是通过相互作用、协调进行而实现的。（1）生物大分子的相互作用主要表现在：DNA与蛋白质之间；RNA与蛋白质之间；蛋白质与蛋白质之间。（2）作用力有：氢键 疏水相互作用 离子键 范德化引力 二硫键 配位键6、生物大分子的自我组装生物大分子的自我组装指线性多肽链和核酸链伸长的线性结构，依照一定的方式折叠或盘绕成有序的形态结构，并通过次级键维持该结构的稳定，或进一步折叠并盘绕形成更高级结构，即超二级和三级空间结构，从而表现出自身的功能，同时这种分子还可以作为亚单位和亚分子和其他类生物分子通过次级键形成更高级结构即四级结构，如血红蛋白，多酶复合物，核酸与蛋白质形成的复合物等。（1）功能类似的分子的组装cAMP-CAP与DNA序列识别并结合；（2）同类生物分子的组装微管与微丝（3）异类生物分子组装蛋白质与核酸（核糖体）烟草花叶病毒粒子（TMV）的自我装配在正常生理条件下，34个蛋白质亚基聚集形成20S双盘结构，RNA嵌入双盘结构，形成装配起始复合物，后蛋白质亚基才逐个加入，完成RNA的包装，最后形成病毒颗粒。7、生物大分子的相互作用（1）核酸与蛋白质的相互作用染色质：是DNA与小分子的碱性蛋白质组成的，组蛋白使DNA在染色体中紧密堆积在一起，并中和DNA磷酸-戊糖骨架负电荷的排斥力。A、阻遏蛋白Cro对噬菌体DNA的结合：Cro蛋白是大肠杆菌噬菌体产生的阻遏蛋白，它可以识别并结合DNA上一段专一序列，是一个重要的调节蛋白，并且二者的结合是由于它们的结构特征，同时Cro蛋白的结合保护了其他蛋白质与DNA作用的特定位点。B、.coli的CAP蛋白与.coliDNA的某一调控位点相结合： 大部分被特异性蛋白识别结合的序列都具有一定的对称性，而且许多顺序特异性的DNA结合蛋白是多亚基蛋白，它们形成对称性的排列，这种排列有助于识别对称序列；另外蛋白质的螺旋通常位于DNA螺旋的大沟中，是DNA-蛋白质相互作用的一个普遍特征。（2）蛋白质与蛋白质的相互作用多亚基形式的组合A、多亚基体系具有的特点：可减少蛋白质合成过程中随机错误对蛋白质活性的影响；对DNA的利用来说，多亚基较为经济；多亚基蛋白质的活性能够很有效和很迅速的被开启和关闭酶的活性调节（3）糖与蛋白质的相互作用A、糖蛋白：是蛋白质与寡糖链通过糖苷键连接成的产物，寡糖链由多种单糖构成，每一个单糖具有半缩醛羟基和一个以上的醇羟基，单糖间可通过不同苷键连接。B、糖蛋白中的糖肽连接类型：在糖蛋白中仅有一种糖残基与天冬酰胺相连，即N-乙酰-b-D-葡糖胺，生成的键是4-N-(2-乙酰氨基-2-脱氧-b-D-吡喃葡糖基)-L-天冬酰胺，这种连接方式有时称为N（或Asn）连接型糖链或N-聚糖。C、糖基或糖链的还原端与蛋白质肽链中的Ser、Thr或羟赖氨酸羟基中的氧原子相连称为O-连接糖链。D、蛋白聚糖：主要存在于人或者动物的皮肤、软骨、角膜等部位的结缔组织中。E、软骨蛋白聚糖是由硫酸角质素和硫酸软骨素与核心蛋白共价结合在一起形成蛋白聚糖单体，由蛋白聚糖单体、连接蛋白和透明质酸形成蛋白聚糖聚集体。（4）脂与蛋白质的相互作用脂蛋白是由脂质和蛋白质相互作用的复合物，脂与蛋白质的结合可以通过蛋白质Ser、Thr上的羟基与脂质上羧基形成酯键，或蛋白质上的-SH与脂质上的羧基形成硫酯键。8、研究生物大分子的方法（1）离心技术分离生物大分子：密度梯度离心 、 等密度离心、差速离心、凝胶电泳技术（DNA分离及大小测定）（2）蛋白质分子质量测定：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳本章习题1、简述生物分子自我组装的定义和种类，并举例说明生物分子的自我组装过程？2、简述生物分子间的相互作用？第3章 核酸的结构与功能1、核酸 DNA是活细胞中最重要的分子，含有特定细胞的全部遗传信息，RNA是某些病毒和噬菌体的遗传物质。2、DNA主要特征：储存遗传信息，将遗传信息传递给子代，物理和化学性质稳定，有遗传变异的能力。作为信息分子的DNA携带有两种不同的遗传信息：一类负责编码组成型蛋白质氨基酸序列的信息以及编码RNA的信息；一类负责编码一大类重要的调控蛋白以及决定基因表达的开启或关闭的序列元件，即负责基因表达的调节控制。3、DNA的基本结构双螺旋结构（1） DNA的一级结构：DNA分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做DNA的一级结构，简称为碱基序列。一级结构的走向的规定为53。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息。一级结构的表示法 ： 结构式，线条式，字母式Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在1950年总结出DNA碱基组成的规律：腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即 A=T。鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数也相等，即G=C。含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，即A+C=G+T。嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。（2）DNA的二级结构双螺旋结构(Watson-Crick模型)为两条反向平行的多核苷酸链，碱基在螺旋内侧；磷酸和脱氧核糖位于外侧。两条链之间靠碱基对之间氢键连为一体，AT GC 。螺旋直径2nm，每个螺圈含10个碱基对，螺距3.4nm 。表面的深沟、浅沟为蛋白识别DNA单一序列并发生作用的基础 。A-DNAZ-DNAB-DNA大沟和小沟：大沟宽2.2nm 小沟宽1.2nm（3）超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式，双螺旋DNA的松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正超螺旋。4、维持DNA双螺旋结构的作用力：（1）氢键： GC 比 A=T更稳定；（2）碱基堆积力：使DNA分子内部形成强有力的疏水区，与分子表面的介质水分子隔开（3）正负电荷作用：DNA分子中磷酸基团上的氧原子带负电荷，能与介质中的阳离子，带正电荷的碱性蛋白质等形成离子键，从而有效屏蔽磷酸基之间的静电斥力。5、DNA的高级结构（1）发夹结构：当一个核酸分子中一段碱基序列附近紧接着一段它的互补序列时，核酸链有可能自身回折配对产生一个反平行的双螺旋结构。（2）回文序列：指在双链DNA序列中按确定的方向阅读双链中的每一条链的序列都是相同的。在双链DNA中，如果两条互补链分开，每条链上的互补序列都有机会发生碱基配对而形成一个发夹结构（对单链而言），两个相对的发夹结构形成了一个十字架形结构（对双链而言）。6、RNA的结构和功能（1）RNA通常是单链线性分子，碱基组成A G C U（2）功能具有多样化，可归纳为两类：信息分子：DNARNA蛋白质；功能分子：蛋白质生物合成的主要参与者初始转录产物的剪接加工与生物体的生长发育密切相关与生物体的进化有很大关系（3）细胞中RNA的分布主要分布在细胞质中7、mRNA：存在于细胞质中真核细胞mRNA是单顺反子，每种mRNA分子只编码一种蛋白质信息，只能作为一种蛋白质的翻译模板，而原核细胞mRNA是多顺反子，即一个mRNA分子只含有几种蛋白质信息，可以编码几种蛋白质。原核生物mRNA特征：先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5ppp5-N-3p）+单顺反子+“尾巴”（Poly A）8、tRNA的结构（1）tRNA含量相对较多，约占真核细胞总RNA的15%，以自由状态或与氨基酸结合成氨酰tRNA。（2）结构特点：含有稀有碱基和稀有核苷较多；3都含有一个CCA序列，是所有tRNA接受氨基酰化的位置；所有的tRNA分子都折叠成紧密的三叶草二级结构和倒L形立体构像rRNA的结构。（3）特征：单链，螺旋化程度较tRNA低与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能5S rRNA的二级结构9、原核生物及真核生物的核糖体组成核糖体亚基rRNA真核生物80s60s28s 5.8s 5s40s18s原核生物70s50s23s 5s30s16s10、核酸的变性、复性与分子杂交（1）核酸的变性凡是破坏双螺旋结构的作用力（主要是氢键和碱基堆积力）的因素都可以使DNA双螺旋解链，导致DNA变性。变性的DNA物理性质、化学性质发生一系列变化，如DNA黏度大大下降，沉降速度增加，浮力密度上升，紫外吸收光谱升高，酸碱滴定曲线改变，生物活性丧失等。（2）引起DNA变性的主要因素有：加热（生理温度以上）；极端PH值。（12，2）；有机溶剂、尿素和酰胺等。（3）通过以下数据衡量DNA链处于什么状态双链DNA的A260=1.00（浓度为50g/ml时的吸收能力），单链时为1.37，游离碱基或者核苷酸为1.60；（4）复性：变性DNA溶液用某种方法处理后，使之重新形成天然DNA的过程叫做复性或退火，重新形成的天然DNA叫复性DNA。复性条件：盐浓度必须高使两链之间的磷酸基团上负电荷的排斥力消失；温度必须足够高防止链内随机形成氢键1）复性的两个阶段：A、单链DNA在溶液中随机地相互碰撞，如果序列互补，则两条链的碱基之间形成短的双链区B、双链区继续扩展，形成一定长度双链2）复性程度检测：A、测定减色效应：跟踪测定A260的光吸收值。B、测定S1核酸酶水解DNA的量 。羟基磷灰石柱层析3）影响复性速度的因素：分子的简单程度；同一种DNA分子，浓度越高，互补链碰撞机会越多，复性速度越快DNA片段大小；温度的影响；阳离子浓度11、核酸的分子杂交分子杂交：将两个不同来源的互补序列退火形成双链的过程。溶液杂交：将不同来源的DNA变性后在溶液里杂交。滤膜杂交：用硝酸纤维素制成的滤膜可以吸附单链DNA/RNA，将变性的DNA/RNA吸附到滤膜上再进行杂交的过程。Southern杂交：DNANorthern杂交：RNAWestern杂交：蛋白质本章习题1、DNA双螺旋结构有哪些形式？说明其主要特点和区别？2、DNA变性的主要因素有哪些？3、变性的定性和定量方法是什么？4、细胞内RNA的结构特点以及与DNA的区别？5、分子杂交一般有几种类型？它们分别用于检测哪些物质？第4章 基因与基因组的结构与功能1、基因：是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制性状的功能单位。2、基因组：是指生物体或者细胞中，一套完整单体遗传物质的总和。不同生物的基因组大小及复杂性不同。生物的复杂性与基因组内的基因数量有关。进化程度越高，基因组越复杂。（1）C值（C-value）：在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量总是恒定的，称为C-值【C-value is the quantity of DNA in the genome(per haploid set of chromosomes).】C值是每种生物的一个特征，不同生物之间差别很大，低等真核生物中与形态学复杂程度相关，但高等真核生物中变化很大（2）C值悖理：是指真核生物中DNA含量的反常现象。表现为：C值不随生物的进化程度和复杂性而增加，如肺鱼的C值为112.2，而人的C值是3.2，与牛的相近关系密切的生物C值相差甚大，如豌豆为14，蚕豆为2，相差7倍，真核生物DNA的量远远大于编码蛋白质等物质所需的量。例：人类与E.coli编码基因数目的比较研究E.coli. 4 X 106bp DNA 约编码3000种基因，人类29 X 108 bp 的DNA是大肠杆菌的700多倍（3）噬菌体（PHAGE ）1）、X174噬菌体：很小的E.coli噬菌体DNA为单链环状，有5386个核苷酸（Frederick Sanger于1977分析测定，为此荣获第二次诺贝尔奖 ）2）、X174噬菌体基因排列更加体现经济原则a、11个蛋白质基因，只转录成三个mRNA；b、DNA分子绝大部分用来编码蛋白质，不翻译部分只占4；c、显著的特点是有重叠基因（overlapping genes 或嵌套基因 nested genes）。（4）重叠基因有以下几种情况：1） 一个基因完全在另一个基因内部 如：B和A E和D 其读码结构互不相同 部分重叠 K和C 2）两个基因共用少数碱基对 如：A*和C D和J噬菌体 ：双链DNA 长度48502bp(48Kb)（5）其DNA分子有三种存在形式a、两个粘性末端分离的线性分子 COS位点(cohesive-end site)b、带有切刻的环状分子（开环的粘性末端互补后未连接的）c、闭合环状分子（粘性末端互补，DNA连接酶连接）（6）大肠杆菌（Escherichia coli E.coli ）特点：a、在实验室中容易操作；b、生长迅速，要求营养物质简单，能进行很多生理生化过程；c、其有性生殖的存在使得遗传学的研究成为可能(遗传杂交、遗传性状 、存在性状 ）；d、能够供应细菌病毒的生长，使病毒的本性即病毒扩增的 深入研究成为可能大肠杆菌的遗传物质1）染色体DNA 对数生长期的E.coli （24个类核）丰富的基因组DNA；类核中，染色体DNA成分占80，其余为RNA和蛋白质；4.6 x 106bp的基因组DNA 与多种DNA结合蛋白质组装成E.coli的染色体；基因组DNA为双链环状，总长度为11001400m，1400个基因都已定位2）E.coli的基因结构的特点 a、功能相关的几个结构基因以操纵子（operon）的形式存在，其中包括共同的调节基因、启动子（promoter）、操纵基因（operator）,在基因转录时协同动作 ；b、包括功能相关的RNA基因也串联在一起(rrn 操纵元)，如：16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA基因转录在同一个转录产物中；c、蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在；d、RNA基因多拷贝大多数的E.coli菌株都含有七个rrn（其中六个分布在 E.coliDNA的双向复制起点附近）3、真核生物基因组特点：（1）真核基因组的分子质量大；（2）真核生物一般有多条呈线状的染色体（3）细胞核DNA与蛋白质稳定地结合，形成染色质的复杂高级结构。染色质内除含有DNA和组蛋白之外，还有大量非组蛋白；（4）真核细胞被核膜分隔成细胞核和细胞质，在基因表达中，转录和翻译在时间和空间上被分隔，不偶联真核细胞基因组DNA有大量重复序列，这些重复序列的单位长度不一，从几个至几千个碱基对不等；重复程度各异。（5）真核生物的蛋白质基因一般以单拷贝形式存在，转录产物为单顺反子mRNA。功能上密切相关的基因密集程度不如原核生物高；（6）真核生物基因组存在着可移动的DNA序列；（7）绝大多数真核生物基因都含有内含子，因此基因的编码区不是连续排列的。4、真核生物的断裂基因（1）断裂基因（interrupted gene）也称割裂基因（splitting gene）不连续基因（discontinuous gene ）：基因内部插入了不编码序列，使一个完整的基因分裂成不连续的若干区段。断裂基因的发现实验：通过成熟mRNA（或cDNA）与编码基因的DNA杂交试验而发现；后来发现鸡的卵清蛋白基因与其mRNA杂交也出现了R环。5、真核生物基因的外显子和内含子概念：在不连续基因中有编码功能的区段称为外显子，而无编码功能的区段称为内含子。Exon (外显子、外元) is any segment of an interrupted gene that is represented in the mature RNA product Intron (内含子、内元) is a segment of DNA that is transcribed, but removed from within the transcript by splicing together the sequences (exons) on either side of it. /6、真核生物基因组的序列类型（1）单拷贝的DNA序列；（2）低度重复的DNA序列，有2-10个拷贝数；（3）中度重复的DNA序列，有几十至数十万个拷贝数；（4）高度重复DNA，重复次数上万至数百万次单一拷贝的基因序列；绝大多数编码蛋白质的基因都是单拷贝的序列。7、持家蛋白：（1）将生物体内所有细胞都共同具有的蛋白质称为持家蛋白。“持家” 维持生命必须的低度重复序列，许多蛋白质家族，其氨基酸序列具有很高的同源性，典型例子有珠蛋白基因、细胞骨架蛋白基因等。（2）珠蛋白家族包括-珠蛋白和-珠蛋白。人类-珠蛋白基因簇在第16号染色体上，由3个基因串联而成。-珠蛋白基因簇在第11号染色体上，由5个基因构成。8、假基因（pesudogene）：是一种类似于基因序列，但在转录、转录后加工或翻译水平上有缺陷，缺乏正常功能，没有表达活性的DNA序列。（1）假基因没有表达活性原因：缺乏有功能的调控区；由于突变和缺失导致mRNA加工缺陷；使mRNA翻译提前终止；产生无功能的肽链；中度重复序列；以Alu序列为代表范例的不编码序列。9、Alu family（Alu 家族）：在长约300bp的片段中，大多数片段含有一个限制性内切酶Alu的酶切位点（AGCT）均匀分散在整个genome中的非重复序列间，在人类genome中占1 3 。/有编码基因产物的rDNA基因、tDNA基因、Histone gene cluster 往往以基因家族的形式组织10、高度重复序列（Highly repetitive sequence）长度2 10bp，重复数百万次 106分为：卫星DNA （satellite DNA）小卫星DNA （minisatellite DNA）微卫星DNA （microsatellite DNA）（1）卫星DNA（Satellite DNA）：将DNA切成数百个碱基对的片段进行超速离心时，由于富含AT的简单高度重复序列区段浮力密度较小，因而很容易和总体DNA分开，即常会在主要的DNA带的上面有一个次要的带相伴随11、真核生物的基因家族和基因簇（Gene cluster、Gene family）（1）基因家族（Gene family）:真核生物的基因组中许多来源相同，结构相似、功能相关的一组基因目前可分为三类：1）简单多基因家族（5SrRNA基因家族）；2）复杂多基因家族（各个成员并不都是相同的a、五个组蛋白基因(果蝇、海胆等的)；b、rRNA、tRNA基因家族往往以串联重复基因簇的形式出现）；3）由发育阶段控制的多基因家族（人类珠蛋白的基因家族）（2）基因簇（gene cluster）：基因家族的各成员紧密成簇，排列成大段的串联重复单位，定位于染色体的特殊区域a、组蛋白基因家族（Histone gene family）组织方式因不同生物而异：基因次序、转录方向、间隔区的长短、重复频率组蛋白基因表达特点： 没有内元 没有多聚A尾巴 b、rRNA 基因家族 （rDNA gene family）c、tRNA基因 d、5SrRNA基因本章习题1、断裂基因、外显子和内含子的概念是什么？它们的关系如何？2、重叠基因最初是在什么生物中发现的？重叠基因存在的意义是什么？3、简述真核生物的DNA序列的几种类型？4、写出下列英文缩写的含义？ HGP STS STR MS ETS SNP SAGE BAC YAC RFLP ORF 2-DE第5章 DNA复制Chapter 5 DNA Replication1、 DNA复制的一些基本概念1、DNA复制：亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。 2、复制子（repicon）：基因组内能够独立进行复制的单位称为复制子或者复制单位。A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator .Repicon：origin . terminator原核生物为1个复制子，真核生物为多个复制子3、 复制起点（origin）以大肠杆菌为例：复制起始片段 OriC. 长245bp。全部富含AT，利于DNA双链解开4、复制终点（ terminator ）以大肠杆菌为例：复制终点在OriC的180 位置上。5、复制叉在复制起点形成的一个特殊的叉形结构。此位置是装配复制相关的酶和蛋白质（拓扑异构酶或解旋酶）的部位；多种酶和蛋白质结合在复制叉位置，形成复杂的复制体结构。6、 复制方向 单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉。复制的多模式 （1）单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）（2）单起点、双方向（原核）多起点、双方向（真核）7、复制的方式（1）比较形象的 复制双链环状DNA的复制眼可以形成一种结构，形状像希腊字母，因而叫.在复制过程中涉及到双链解旋产生相反方向的正超螺旋旋转，因此DNA的主链骨架要切断产生切口，利于DNA解旋，复制叉前移。（2）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）:由于复制时产生的滚环形状象，又称复制 。病毒、细菌因子 例如产生单链环状174 的过程是一个典型例子 （3）置换式（Displacement form ）又称 D 环复制 如线粒体和叶绿体DNA的复制方式二、DNA复制酶体系(Enzymology of DNA Replication)1、与DNA聚合反应有关的酶包括多种DNA聚合酶和DNA连接酶 （1）聚合反应：底物dNTP Poly(核苷酸)n3-OH dNTP Poly(核苷酸)n+13-OH 2Pi （2）聚合酶催化的反应特点：以4种dNTP作为底物；反应接受模板指导；链延伸需要有引物3-羟基存在；链延伸的方向为5-3；产物DNA的极性与模板相对2、肠杆菌DNA聚合酶 I、II、 III 的性质比较性质聚合酶 I聚合酶II聚合酶III35+5-3+新生链的合成+生物学活性10.0515生物学功能切除引物修复DNA修复DNA修复（1）DNApol结构和功能1）5-3的聚合酶活性：主要用于DNA的修复和RNA引物的替换；2） 35 外切核酸酶活性： 校对功能(proofreading)；3）53外切核酸酶活性。DNApol的53外切活性有以下三个特点：必须有5磷酸末端；被除去的核苷酸必须是已经配对的；被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切口平移）；蛋白水解酶将DNApol有限水解，可得到大小两个片段，大片度称为Klenow片段（2）DNApol结构和功能DNApol由十种亚基组成，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；亚基具有35外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。亚基的功能如同夹子，两个亚基可夹住DNA分子相对滑动，使聚合酶在完成复制前不脱离模板DNA而持续聚合。DNApol 和DNApol 的共同功能：多亚基酶；5-3聚合活性；3-5的外切核酸酶活性；DNApol 在体内功能尚不清楚，可能参与DNA修复（3）DNA连接酶1）所需条件：a、 切刻的 3OH 和 5P 相邻；b、 切刻各自碱基处于配对状态；c、需要能量 原核（ATP、NAD） 真核（ATP）2）用途： 复制过程中，5 端RNA引物被置换后切刻的连接、修复、重组3、 与DNA几何学性质相关的酶1、解螺旋酶 （helicase）:又称解旋酶单链结合蛋白（SSB single-strand binding protein）2、 DNA旋转酶 ：消除复制叉前进过程中产生的正超螺旋，产生负超螺旋（1）DNA复制的保真性：为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1）遵守严格的碱基配对规律；2）DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3）对复制过程中出现的错误及时进行校正。 （2）DNA复制的拓扑性质DNA复制的拓扑性质是通过拓扑异构酶实现的，将共价闭环的超螺旋DNA变成松弛态1）型拓扑异构酶（Topo）主要消除负超螺旋，先切开双链DNA中的一条链，使链末端沿螺旋方向转动，然后封闭切口2）型拓扑异构酶（Topo）利用水解ATP提供的能量，连续向同一个双链闭环DNA分子中引入负超螺旋，从而抵消DNA复制中产生的正超螺旋（3）原核拓扑异构酶作用机制：酶与DNA结合使双链解旋；使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转；酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来；酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋3、DNA的半不连续复制：没有发现DNA能按35合成的证据（1）细菌DNA复制过程1）E.Coli复制的起始：DnaA蛋白功能：只与处于负超螺旋的DNA分子结合，在ATP参与下，结合在OriC中4个9bp重复序列形成起始复合物，促使OriC中3个富含AT的13bp重复序列解旋形成解链复合物，需要ATP参与，HU对此过程有促进作用，引导DnaB-DnaC复合物进入局部解链区，形成引发前体复合物（前引发体）。DnaB蛋白功能：解旋酶的功能，解开DNA双螺旋，活化引物合成酶；促使其合成RNA引物；DnaB和DnaC形成前引发体，后促进DnaG蛋白结合，完成引发体组装；引发体组装后，引发合成RNA引物2）复制的延伸（ E.Coli ）在延伸阶段，包括前导链和后随链的合成，前导链持续合成，后随链分段合成，伴随着亲代链的解旋，SSB稳定形成复制叉。延伸过程归纳：前导链的合成：全酶异二聚体的一个亚单位与前导链模板结合，在引物RNA合成的基础上，连续的合成DNA，其行进方向与复制叉一致。后随链的合成： 后随链的模板形成回环，聚合酶异二聚体中的一个亚单位和引发体都与后随链模板结合，准备开始合成引物；引物行进5-3方向合成，由于模板呈环状，引物行进方向与复制叉方向一致；模板链的环不断扩大，在引物3-OH端开始合成DNA片段，合成方向为5-3；当DNA新片段合成到距离前一片段的5端仅剩一小空隙时，酶的行进受阻，模板链解环，新合成的片段随机移动到与复制叉行进相反的方向，至此一个冈崎片段合成。以上过程周而复始，DNApoly切除RNA引物，填补空虚，DNA连接酶连接。回环模型：后滞链模板形成了一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制3） 复制的终止（ E.Coli ）在正常情况下，两个复制叉前进速度相等，到达终止区后停止复制，然而如果其中一个复制叉前移受阻，另一个复制叉复制过半后，则受到对侧Tus-ter复合物的阻挡，等待前一复制叉的汇合。4、真核生物DNA的复制真核生物的DNA聚合酶：、五种真核生物染色体端粒的复制；真核生物不同于原核生物一样，填补5端空缺；真核生物能够通过形成端粒结构以及具有逆转录酶活性的端粒酶防止DNA复制时后随链缩短而产生的染色体短缺；端粒酶可以外加重复单位到5端，维持端粒一定的长度；后随链的模板链被不完整复制，子代DNA5端序列逐步缩短，导致后随链合成的子代单体DNA都要短一截真核生物线性染色体的两个末端具有特殊的端粒结构。富含G的3 OH端具有长为12-16nt的一条单链突出末端。补齐过程：通过TG链的回折形成发夹结构，成为引物，复制后随链的5。GG氢键：非碱基配对有利于DNA-RNA杂交链之间的相对滑动）实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值时，细胞终止分裂衰老、死亡“多莉”的衰老：研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命；研究推测端粒酶与肿瘤的关系DNA复制的调节控制；5、原核细胞复制的调节控制：（1）细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率高低Ecoli复制起始：DnaA浓度的高低 GATC上的A是否被完全甲基化6、真核生物DNA复制的调控（1）细胞生活周期水平上的调控：G1S 检验点（限制点） 细胞环境、营养条件等（2）染色体水平上的调控：不同染色体或同一染色体的不同部位，复制子按照怎样的顺序起始复制，机制不清.（3）复制子水平上的调控：决定复制的起始与否本章习题1、解释名词概念 半保留复制 复制子 ARS OriC RF SSB Klenow 片段 冈崎片段 回环模型2、简述174噬菌体复制过程？3、大肠杆菌染色体DNA的复制起点如何？什么是双向复制？4、列出原核生物DNA复制的酶和蛋白质因子体系？5、与DNA复制的忠实性有关的因素是什么？6、真核细胞中DNA复制有哪3个水平的调控？第六章DNA的损伤、修复和基因突变1、 DNA损伤：在生物体生命过程中DNA双螺旋结构发生的任何改变。（1）包括：1）单个碱基的改变通过序列的变化改变子代遗传信息；2）双螺旋结构的异常扭曲对DNA复制或转录产生生理性伤害（2）产生因素：自发性损伤、代谢物质、物理、化学因素引起的损伤1）自发性损伤互变异构移位：碱基发生烯酮式酮式结构互变；脱氨基作用： A C G 脱氨基 AI CU；DNA聚合酶的“打滑”：引起一个或数个碱基的插入或缺失；活性氧引起的诱变： H2O2对DNA造成氧化损伤；碱基缺失：自发性水解2）物理因素 UV照射 电离辐射3）化学因素 烷化剂 碱基类似物2、DNA的修复：生物体细胞在长期进化过程中形成的一种保护功能，维持遗传信息的稳定性。修复系统有五种：切除修复 错配修复 直接修复 重组修复 易错修复和SOS反应（1）切除修复1）碱基切除修复修复单个碱基缺陷的损失；特异性酶识别损失部位，切除该碱基，DNA聚合酶合成新链，连接酶连接。2）核苷酸片段切除修复DNA双螺旋结构有较大的损失变性时，以核苷酸片段切除修复为主。（2）错配修复原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使位于5GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列，一旦发现错配碱基，即将未甲基化链切除一段包含错误碱基的序列，并以甲基化的链为模板进行修复。（3）直接修复把被损伤的碱基回复到原来状态的一种修复。生物体内存在多种DNA损伤以后而并不需要切除碱基或核苷酸的机制，这种修复方式称为DNA的直接修复。包括：光复活作用、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）直接修复、单链断裂修复（4）重组修复遗传信息有缺损的子代DNA分子通过遗传重组的方式加以弥补，即从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。（5）复制后修复 容易出错RecA, DNApolymerae ligase，重组修复后的损伤位点可由其它机制进一步修复（6）易错修复和SOS反应SOS反应：许多能造成DNA损伤或抑制DNA复制的过程能引起一系列复杂的诱导效应，这种效应称为应急反应（SOS response）。细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效应。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错修复(error free repair)和易错修复(error-prone repair)（7）避免差错修复(error free repair)：切除修复 错配修复 直接修复 重组修复 易错修复：容许错配，增加细胞存活的机会SOS反应包括两方面的内容：DNA修复导致变异SOS 修复只是SOS反应的一部分SOS repair 是一种错误倾向性极强的修复机制3、基因突变的类型：（1）碱基替换（点突变）：碱基替代（2）插入突变在基因序列中插入了一个碱基或者一段外来DNA导致的突变。拷贝或复制移动；非拷贝转换；移码突变；由于一个或者多个非三整倍数的核苷酸对插入或缺失，导致编码区该位点后的三联体密码子可读框改变，从而使后面的氨基酸都发生错误，使该基因失活；如出现终止密码子使翻译提前结束。GUAGUAAGC GUAGUAAGC（3）同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子（4）错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变（中性突变、渗漏突变）（5）无义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白合成的终止密码子（6）缺失突变：只一个或多个碱基从一段DNA序列中被删除，或较长核苷酸序列丢失引起的突变，这种突变难以被回复。（7）渗漏突变：是突变基因的产物尚有部分活性的错义突变。（8）回复突变：从突变体又恢复原先野生型表现型的突变过程。（9）突变热点：在某些位点发生突变的频率远远高于其平均数。4、诱变剂的作用：能够提高突变率的物理或化学因子，为诱变剂（1）诱变剂的类型：1）物理诱变剂：射线 射线等2）化学诱变剂：许多天然的、合成的有机或无机的化学物质。3）碱基类似物碱基的修饰剂嵌入染料：吖啶橙 溴化乙锭4）紫外线和电离辐射5、基因突变的后果生物功能的丧失某一基因突变后使其所表达的蛋白质或酶失活，有时还会引起其他种类酶的缺乏。有些突变还可产生功能获得性显性表现型。许多肿瘤特异的染色体重排产生的嵌合基因可以导致无法控制的细胞增殖。本章习题1、什么是DNA损伤？DNA结构的改变有哪两种类型？其危害有哪些？2、化学因素引起的DNA损失主要有哪几种？3、什么是DNA的修复？4、什么是SOS反应？SOS反应由什么物质引起？5、基因突变的几种类型？什么叫热点突变？第7章 DNA重组与转座一、概述1、只要有DNA，就会发生重组生存变异突变，重组损伤修复、适应环境、加速进化2、 广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程3、 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流4、 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）类型需同源序列需RecAll蛋白需序列特异性的酶位点特异性+同源+转座-+不正常-？5、遗传重组与重组DNA技术二、同源重组homologous recombination：1、同源重组：发生在同源DNA序列之间特征：涉及同源序列间的联会配