分光光度法测定纤维素酶酶活

RS/TN/ZL-004 分光光度法测定纤维素酶酶活 版号/修改：A/0 共 4页 第 3 页 分光光度法测定纤维素酶酶活1 适用范围本方法适用于纤维素酶酶活的测定。2 测定原理纤维素酶在一定温度与pH条件下，水解纤维素分子中糖苷键，生产纤维素寡糖、纤维二糖和葡萄糖，在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖发生氧化-还原反应，生产3-氨基-5-硝基水杨酸。其产生物在煮沸条件下 ，其颜色深浅与还原糖含量成正比，可用分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解纤维素产生1g还原糖为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。3 仪器和设备3.1 分析天平：精度为0.0001g。3.2 紫外分光光度计。3.3 恒温水浴锅：精度0.2。3.4 PH计：精度为0.01PH单位。4 试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。4.1 柠檬酸缓冲液（pH=5.0）磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml。 柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中，定容至100ml。取上述配制的磷酸氢二钠溶液24.3ml、柠檬酸溶液25.7ml混匀即为柠檬酸缓冲液，其pH值为5.0。4.2 羧甲基纤维素溶液（CMC溶液） 称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200ml水中，于沸水浴中加热至溶解，过滤，取滤液100ml，加柠檬酸缓冲液20ml，蒸馏水40ml，混匀，储存于4条件下备用。4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂） 称取3,5-二硝基水杨酸6.3g加入到约600ml水中，逐渐加入氢氧化钠20.8g，在50的水浴中加热搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠182g，苯酚5g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤。滤液储存于棕色瓶中暗处放置7天后使用。4.4 标准葡萄糖溶液（1mg/mL）准确称取105烘干至恒重的无水葡萄糖250.000毫克，溶于蒸馏水中，定溶至250ml。5 分析步骤5.1 标准曲线的绘制5.1.1 葡萄糖标准溶液：按表1配置。表1编 号葡萄糖标准溶液的浓度（mg/mL）取1mg/mL葡萄糖标准溶液的体积 mL取水的体积mL吸光值Abs.0002.510.042020.084030.126040.168050.20100分别吸取1mg/ml标准葡萄糖溶液（4.4）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，用水分别定溶至50ml。再分别吸取上述溶液各10.0ml于试管中，各加DNS试剂10ml，混匀后于沸水中煮5min，（另作一个对照，取10.0ml蒸馏水加10mlDNS试剂，同样煮5min），冷却后，用分光光度计于530nm波长处测吸光值（比色皿10mm*10mm），以吸光度为纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 5.2 样品测定5.2.1 待测酶液的制备液体酶样：准确吸取样品10.0ml于100ml容量瓶中，用适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）定容至刻度。控制稀释样品酶活力在100u/ml1000 u/ml范围内。固体酶样：准确称取样品4.0g，精确至0.0002g。用适量适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）溶解后，定容至100ml。再将定容溶液用定性滤纸过滤后，准确吸取10.0ml，用相应溶剂定容至100ml。控制稀释样品酶活力在100u/ml1000 u/ml范围内。5.2.2 测定按下列程序操作： 试管A（空白） 试管B（酶试样，需作三个平行试样）加CMC溶液8.00 mL 加CMC溶液8.00 mL 500.2保温，3min 500.2保温，3min 加DNS试剂10.00 mL（摇匀） 加酶液2.00mL（摇匀） 500.2保温，30min（精确计时） 500.2保温，30min（精确计时） 加酶液2.00mL（摇匀） 加DNS试剂10.00 mL（摇匀） 沸水煮沸，10min 沸水煮沸，10min 冷却至常温 冷却于530nm波长，测定样品葡萄糖浓度6 结果计算6.1 液体样品酶活力的计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/ml。样品的酶活力按式（1）计算： （1）式中：X样品的酶活力（u/ml） C由标准曲线读出的还原糖的浓度（mg/ml） n所测样品稀释倍数 20检测试样体积（ml） 1000将还原糖单位mg换算为g 60将酶液体积换算为1ml，水解时间换算为1min。 所得结果表示至整数。6.2 固体样品酶活力的计算固体样品的酶活力换算按式（2）计算： （2）式中：固体样品的酶活力，(u/g)；固体样品溶解定容后的酶活力，(u/mL)；样品定容体积，ml；称取样品的质量，g；所得结果表示至整数。7 检验注意事项7.1 缓冲溶液配制注意事项 缓冲溶液配制完成后，用PH计测定其PH值，若PH值不在规定范围内，需用相应的试剂调PH值至规定要求。7.2 多个样品同时检验注意事项 如果有多个样品进行检测