SDS-PAGE凝胶电泳技术(原版)

.,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-PolyacrylamidegelelectrophoresisSDS-PAGE食品科学王玲华,.,一、什么是SDS,十二烷基硫酸钠一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。,.,SDS的作用,破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质解聚而改变原有的构象，保证解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。,.,二、SDS-PAGE的基本原理,（一）蛋白质分子的解聚样品介质和聚丙烯酰胺中加入阴离子去污剂SDS和强还原剂后，蛋白质分子解聚，与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而蛋白质原有电荷因素可以被忽略。,.,1、SDS阴离子去污剂变性剂助溶性试剂断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构,.,2、强还原剂巯基乙醇（-mercaptoethanal）二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。,.,.,蛋白质-SDS复合物的特点：（1）形状像一个长椭圆棒。（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。（4）所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋白质分子间原有电荷差异。,.,复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,.,3、影响SDS电泳的关键因素（1）溶液中SDS单体浓度（1mmol/L)大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4（2）样品缓冲液的离子强度（不0.26)低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。（3）二硫键是否完全被还原当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。,.,（二）缓冲系统的选择一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。,.,电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度要比后者快一倍。4、尿素系统：适用分子量低于15KD的蛋白样品。5、Tris-甘氨酸系统：使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量,.,（三）凝胶浓度的选择由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度.,.,凝胶浓度与被分离蛋白质分子量大小关系如表1,.,三、分离方法,1、分类（1）根据对样品的处理方式的不同还原SDS电泳非还原SDS电泳带有烷基化作用的还原SDS电泳,.,（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同连续电泳不连续电泳（3）根据电泳的形式圆盘电泳垂直电泳平板电泳水平电泳,.,2、操作要点（1）制备凝胶丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（BIS）在催化剂的作用下聚合。过硫酸铵和四甲基乙二胺（化学聚合催化剂）催化剂核黄素（光聚合的催化剂,.,不连续电泳使用不同孔径的凝胶，使用不同的pH和缓冲液。不连续电泳的凝胶由上至下可分为：(1)样品胶：大孔径凝胶，在pH6.76.8的Tris-HCL中聚合，含有样品。（2）浓缩胶：除不含样品外，其他与样品胶相同。（3）分离胶：小孔径凝胶，在pH8.88.9的Tris-HCL中聚合.,.,.,.,（2）电极缓冲液的选择（3）电泳加样后，接通电源。开始时将电流调至10mA。待样品进入分离胶时，将电流调至2030mA继续电泳，直至溴酚蓝染料到达分离胶底部上方约1cm时，关闭电源。拔掉固定板，取下玻璃板，取出胶板。,.,（4）染色和脱色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，浸泡在含0.5%氨基黑10B的7%醋酸染色体中，或浸泡在含0.1%考马斯亮蓝的12.5%-50%的三氯醋酸染色液中。进行染色和蛋白质的固定。染色12小时或过夜。染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。,.,3、电泳过程中的不正常现象,（1）“微笑”现象指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。,.,（2）“皱眉”现象由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。,.,.,（3）“拖尾”现象样品溶解不佳引起。,.,（4）偏斜现象电