荧光分光光度计课件.ppt

2020/6/3,光学分析仪器培训,1,光学分析仪器（2）,荧光分光度计的原理与应用技术,2020/6/3,光学分析仪器培训,2,荧光分光光度法,光学分析仪器主要是通过电磁波与物质互作用后，物质对电磁辐射产生吸收或再发射，测量所得到的信息来对物质加以研究的分析仪器。这方面的仪器很多,在这里我们主要对紫外可见分光光度计和荧光分光光读计加以讨论。,1、荧光分光光度法简介,2020/6/3,光学分析仪器培训,3,荧光分光光度法,光学分析仪器因为物质对光的选择性吸收的特点，他的吸收有如下的特性M+hM*M+热基态激发态M+荧光或磷光,1、荧光分光光度法简介,2020/6/3,光学分析仪器培训,4,荧光分光光度法,原子发射光谱法：原子荧光分析发射光谱法分子发射光谱法：荧光分析、磷光分析光谱分析法原子吸收光谱法：原子吸收分光分析吸收光谱法分子吸收光谱发：紫外可见、红外吸收光谱,1、荧光分光光度法简介,2020/6/3,光学分析仪器培训,5,荧光分光光度法,荧光分光光度法当用紫外光照射某种物质时，这些物质会发出各种颜色和不同强度的光，当紫外光停止照射时，这种光线也随之消失。我们这种光线称为荧光。依据物质所发荧光的颜色和强度建立起来的定性和定量的分析方法称为荧光分光光度法。,1、荧光分光光度法简介,2020/6/3,光学分析仪器培训,6,荧光分光光度法,荧光的产生：荧光是一种自然现象，在我们的日常生活中到处可以看见。产生荧光的原因是：荧光物质分子吸收了特征频率的能量后，由基态跃迁到激发态，然后内能转换消耗部分能量，返回到最低电子激发态的最低振动能级，再从这个能级返回基态时所发的光，这束光我们称为荧光。荧光发射的能量要比吸收光的能量小（波长要长）。在这里我们用分子能级图就能够很好的理解它的产生过程。,1、荧光分光光度法简介,2020/6/3,光学分析仪器培训,7,荧光分光光度法,分子能级图：,1、荧光分光光度法简介,2020/6/3,光学分析仪器培训,8,荧光分光光度法,荧光分析仪器的结构和主要部件：,2、荧光分光光度计的基本结构,光源,激发单色器,样品室,发射单色器,检测器,显示装置,2020/6/3,光学分析仪器培训,9,荧光分光光度法,2、荧光分光光度计的基本结构,2.1、光源：对光源的要求是必须有足够的强度且具有连续光谱，其波长范围能满足仪器的需要。大部分仪器由氙灯组成它对能量的要求没有紫外可见分光光度计那么严格。,2020/6/3,光学分析仪器培训,10,荧光分光光度法,2、荧光分光光度法简介,2.2、单色器：色器也是荧光分光度计的核心部件。它有两个单色器激发单色器它的作用是将光源发出的白色光色散成各种波长的单色光用于照射样品，发射单色器的作用只让样品发出的荧光通过。,2020/6/3,光学分析仪器培训,11,荧光分光光度法,2、荧光分光光度计的基本结构,2.3、样品室样品室比较宽大，以容纳各种光径的样品池和附件。如流动池，微量池等。样品池全用石英材料制成，没有玻璃样品池。,2020/6/3,光学分析仪器培训,12,荧光分光光度法,2、荧光分光光度计的基本结构,2.4、检测器荧光分光光度计常用的是光电检测器。如光电池、光电管、光电倍增管和二极管阵列j检测器。现在大部分是光电管2.5、记录和放大装置：将测量到的荧光强度显示出来。,2020/6/3,光学分析仪器培训,13,荧光分光光度法,荧光分光光度计于紫外-可见分光光度计的区别,2、荧光分光光度计的基本结构,2020/6/3,光学分析仪器培训,14,荧光分光光度法,2、荧光分光光度计的基本结构,2.6、日立850荧光分光光度计光路图：（,2020/6/3,光学分析仪器培训,15,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.1、特点有以下几点：（1）灵敏度高荧光分析的最大特点是灵敏度高，通常比紫外可见光度计高出23个数量级。（2）选择性强荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。因此确定恰当的激发光谱和发射波长，能达到很高的选择。,2020/6/3,光学分析仪器培训,16,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,（3）试样量少和方法简单由于荧光分析法灵敏度高，因而分析时需试样量较小。特别在使用微量池时，用样量可以大大减小。（4）能获得更多的信息荧光分析可提供激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧光量、峰位、谱带宽度、量子产率、荧光寿命等参数。,2020/6/3,光学分析仪器培训,17,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,（5）受外界影响较大外界因素如温度、PH值、溶剂和其它因素都可能显著地影响分析结果。其中温度对他的影响最大，这也是荧光分析需标准的原因。,2020/6/3,光学分析仪器培训,18,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.2、荧光分光光度法的发展近年来，荧光分光度计随着新技术的的采用，发展非常快，特别是计算机和其它先进技术应用的引入，是荧光光度计发生了根本的变化，相应的分析方法也得到很快的发展，象激光荧光分析技术、时间分辨荧光分光光度法、同步荧光分析法，这些又大的推动了分析方法在理论和应用方面的进展。同时促进荧光分析技术的不断完善。,2020/6/3,光学分析仪器培训,19,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：荧光和分子结构的关系是个比较重要而复杂的问题，但是，由于对激发态分子的性质了解得不多，所以对他们的关系还不十分清楚。一般来说，能发出荧光的物质具有较大的吸收光能力、较高的荧光量子效率和合适的环境。分子中含有能发荧光的基团称为荧光团。对于能产生荧光的物质与分子结构之间关系的描述可简单的总结以下几点，仅供参考。,2020/6/3,光学分析仪器培训,20,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：3.3.1、有机物的荧光（1）共轭效应：具有共轭双键的芳环或杂环化合物，其电子共轭程度越大，越容易产生荧光;环越多，发光峰红移程度越大,发光也越强。同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构的荧光波长比非线性者要长。,2020/6/3,光学分析仪器培训,21,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：（2）鳌合物中配位体的发光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性的分子不处于同一平面，因而不发荧光。若这些化合物和金属离子形成鳌合物，随着分子的刚性增加，平面结构增大，常常会发荧光。,2020/6/3,光学分析仪器培训,22,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：（3）刚性结构和平面结构效应：一般来说，荧光物质的刚性和平面性增强，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小，既使外转移能量损失减小，从而有利于荧光的发射。如果分子内取代基之间形成氢键，加强了分子的刚性结构，其荧光强度将增加。,2020/6/3,光学分析仪器培训,23,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：取代基的类型和位置：取代基对荧光体的影响分为加强荧光的、减弱荧光的和影响不明显的。加强荧光的取代基有OH、OR、NH2、CN、NHR、NR2、OCH3等给电子取代基，由于它们n电子的电子云几乎与芳环上的轨道平行，因而共享了功轭电子结构，同时，扩大了共轭双键体系。,2020/6/3,光学分析仪器培训,24,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：减弱荧光的有COOH、NO2、NO、SH等得电子取代基，它们n电子的电子云并不与芳环上电子平面。影响不明显的取代基有NH3、R、SO3H等。（4）电子跃迁类型：含有氮、氧、硫杂原子的有机物，它们的荧光强度与电子跃迁类型有关。,2020/6/3,光学分析仪器培训,25,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：3.3.2、金属鳌合物的荧光：除过元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是,在某些条件下，金属鳌合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定。,2020/6/3,光学分析仪器培训,26,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：（1）鳌合物中配位体的发光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性的分子不处于同一平面，因而不发荧光。若这些化合物和金属离子形成鳌合物，随着分子的刚性增加，平面结构增大，常常会发荧光。,2020/6/3,光学分析仪器培训,27,荧光分光光度法,3、荧光分光光度法的特点,3.3、荧光和分子的关系：（2）鳌合物中金属离子的特征光谱：这类发光过程通常是鳌合物首先通过配位体的*跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，导致dd*或ff*路迁，最终发射的是d*d或f*f路迁光谱。,2020/6/3,光学分析仪器培训,28,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.1、激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光分析法进行定量和定性分析是的基本参数和依据。因次我们在学习荧光分光光度法时要对它加以了解。,2020/6/3,光学分析仪器培训,29,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.1.1、激发光谱:将样品放入光路中选择合适的发射单色器的波长和带宽并使之固定不变，让激发单色器的波长扫描，所得的图谱既为激发光谱。它反映了物质的荧光强度对激发波长的关系。,2020/6/3,光学分析仪器培训,30,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.1.1、激发光谱:,F,激发,2020/6/3,光学分析仪器培训,31,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.1.1、激发光谱:它的特性：激发光谱从理论上讲同一物质的最大激发波长和最大吸收波长一致，但由于荧光测量仪器的特性如光源的分布、单色器的透射和检测器响应的影响，实际测量的荧光激发光谱与吸收光谱不完全一致。,2020/6/3,光学分析仪器培训,32,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.1.2、发射光谱（也叫荧光光谱）：将荧光样品放入光路中后，选择合适的激发单色器波长与带宽使之固定不变，让发射单色器的波长扫描图谱，所得光谱既为发射光谱。它反映了物质的荧光强度对发射波长的关系。,2020/6/3,光学分析仪器培训,33,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.1.2、发射光谱（也叫荧光光谱）：F,发射,2020/6/3,光学分析仪器培训,34,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.1.2、发射光谱（也叫荧光光谱）：荧光光谱通常具有如下特性；（1）斯托克斯位移；（2）荧光发射光谱的形状与激发光波长无关；（3）荧光光谱与吸收光谱的镜像关系。,2020/6/3,光学分析仪器培训,35,荧光分光光度法,分子能级图：,4、荧光分析中常用参数,2020/6/3,光学分析仪器培训,36,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.2荧光强度荧光强度是表示发射相对强度的物理量，它是最常用的荧光参数之一。目前一般的商品仪器都采用荧光强度来表示，所以单位为任意单位，表示的是相对强度。,2020/6/3,光学分析仪器培训,37,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.2荧光强度物质发射的荧光强度与它吸收的光能成正比，当测量的溶液很稀时，可用如下公式表示：F=KI0CL,2020/6/3,光学分析仪器培训,38,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：4.2荧光强度F=KI0CLF-荧光强度K-仪器常数I0-激发光强度C-样品浓度L-池的光径长度-样品消光系数-样品的量子产率,2020/6/3,光学分析仪器培训,39,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.3、量子产率：因为荧光强度只是相对强度，只能在同一仪器相同条件下加以比较，所以要想比较不同物质的荧光强弱，应当用量子产率来表示。量子产率=发射量子数/吸收量子数,2020/6/3,光学分析仪器培训,40,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭广义的讲,指任何可使某种荧光物质的荧光强度下降的作用或任何可使荧光量子产率降低的作用。狭义的说,荧光熄灭指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。,2020/6/3,光学分析仪器培训,41,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭导致荧光熄灭作用的几种主要类型:a碰撞熄灭;b能量转移;c电荷转移;d转入三重态;e光化学反应熄灭;f自熄灭和自吸收;,2020/6/3,光学分析仪器培训,42,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭a碰撞熄灭;碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因是指处于激发单重态的荧光分子与熄灭剂发生碰撞，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生荧光熄灭。碰撞熄灭与溶液的粘度有关，粘度大熄灭作用较小。,2020/6/3,光学分析仪器培训,43,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭b能量转移;这种熄灭作用产生于熄灭剂与处于激发但重态的荧光分子作用后，发生能量转移是熄灭剂得到激发。如果溶液中熄灭剂浓度足够大，可能引起荧光物质的荧光光谱发生畸变，造成荧光强度测量的误差。,2020/6/3,光学分析仪器培训,44,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭c电荷转移;这种熄灭作用产生于熄灭剂与处于激发态分子间发生电荷转移而引起的。由于激发态分子往往被基态分子具有更强的氧化还原能力，因此荧光物质的激发态分子比基态分子更容易与其它物质的分子发生电荷转移作用。,2020/6/3,光学分析仪器培训,45,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭d转入三重态;由于内部能量转移，发生由激发单重态到三重态的系间窜跃，多余的振动能在碰撞中损失而使荧光熄灭。,2020/6/3,光学分析仪器培训,46,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭e光化学反应熄灭;由光致激发态分子所发生的化学反应称为光化学反应，它可以是单分子也可以是双分子反应。荧光分析中因发生光化学反应导致熄灭现象经常遇到，其中，影响最大的是光解反应。表现在荧光测定过程中荧光强度随光照时间而减弱。,2020/6/3,光学分析仪器培训,47,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.4、荧光的熄灭f自熄灭和自吸收;当荧光物质浓度较大时，经常发生自熄灭现象，使荧光强度降低。这可能是由于激发态分子之间的碰撞引起的能量损失。当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被溶液中处于基态的分子吸收。称为自吸收。,2020/6/3,光学分析仪器培训,48,荧光分光光度法,4、荧光分析中常用参数,：,4.5、荧光分析法的灵敏度a、绝对灵敏度Sa；是用荧光物质的量子产率和摩尔吸收系数的乘积。b、以硫酸奎宁的检出线表示仪器的灵敏度。c、用纯水拉曼峰信噪比(S/N)表示仪器的灵敏度。,2020/6/3,光学分析仪器培训,49,荧光分光光度法,5、荧光分光光度计的分析方法,：,5.1、定性分析荧光分光光度剂的定性分析是根据扫描出来的激发光谱和发射光谱进行的特性定性分析。,2020/6/3,光学分析仪器培训,50,荧光分光光度法,5、荧光分光光度计的分析方法,：,5.2、定量分析定量分析的依据是荧光强度的关系公式进行定量分析的，其主要的分析方法有：标准曲线法、标准样品对照法和内标法。,2020/6/3,光学分析仪器培训,51,荧光分光光度法,5、荧光分光光度计的分析方法,：,5.2、定量分析5.2.1标准曲线法；配制一系列标准溶液，其浓度在待样品的浓度范围内。选择合适的激发、发射波长其荧光强度并与浓度C绘制标准曲线，在测未知样品的强度，从标准曲线上可查出未知样品的浓度。,2020/6/3,光学分析仪器培训,52,荧光分光光度法,5、荧光分光光度计的分析方法,：,5.2、定量分析5.2.1标准曲线法；,荧光强度,标准溶液浓度,2020/6/3,光学分析仪器培训,53,荧光分光光度法,5、荧光分光光度计的分析方法,：,5.2、定量分析5.2.2、内标法：在样品溶液中加入已知的标准溶液分别测量样品加标准溶液、样品溶液和空白溶液的荧光强度，在根据它们之间的关系进行计算。,2020/6/3,光学分析仪器培训,54,荧光分光光度法,5、荧光分光光度计的分析方法,：,5.2、定量分析5.2.3、标准、样品对照法(单点校正法)当样品溶液遵循荧光强度的关系，可在相同测量条件下测量标准溶液和样品溶液的强度。测量得到的强度度分别为A标和A样，荧光强度的关系,2020/6/3,光学分析仪器培训,55,荧光分光光度法,5、荧光分光光度计的分析方法,：,5.2、定量分析5.2.3、标准、样品对照法(单点校正法)F样/F标=C样/C标式中：标准和样品的荧光强度可以测出来，C标是已知的，因此待测样品浓度C样可计算出来。,2020/6/3,光学分析仪器培训,56,荧光分光光度法,6、荧光测定所用基本的方法,：,6.1、直接测定法：是利用荧光物质自身的荧光，即所谓自身荧光或内源荧光来进行测定。只要分析物质本身所发荧光，便可通过测量它的荧光强度测定其浓度，如果有其它干扰物质存在时，则要预先加以分离。,2020/6/3,光学分析仪器培训,57,荧光分光光度法,6、荧光测定所用基本的方法,：,6.2、间接测定法：有众多的有机化合物发及绝大多数的无机化合物溶液，它们可了可能不发荧光，或者因荧光量子产率很低而只显现很微弱的荧光，无法直接测定，只能采用间接的办法。间接测定的方法有多种，可按分析物质的具体情况加以选择。,2020/6/3,光学分析仪器培训,58,荧光分光光度法,6、荧光测定所用基本的方法,：,6.2、间接测定法：6.2.1、化学反应法这种方法是通过化学反应将非荧光物质转变为适合于测定的荧光物质.如许多金属离子可以通过使它们与某些有机螯合物反应之后加以测定。,2020/6/3,光学分析仪器培训,59,荧光分光光度法,6、荧光测定所用基本的方法,：,6.2、间接测定法：6.2.2、荧光淬灭法如果分析物质本身不发荧光，然而又具有使某种荧光化合物的淬灭能力，可通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测量该物质。,2020/6/3,光学分析仪器培训,60,荧光分光光度法,7、荧光分析中注意事项,：,7.1、溶剂和化学试剂溶剂的选择要考虑两个问题：一是溶剂的选择要适宜，二是溶剂应达到足够的纯度。如果溶剂在一定波段范围内有光吸收，就不宜在此波段用作荧光溶剂；同一种荧光在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都可能会有显著的不同。因此，要选择合适的溶剂，达到所要求的目的。,2020/6/3,光学分析仪器培训,61,荧光分光光度法,7、荧光分析中注意事项,：,7.2、荧光污染荧光污染的来源有多个方面，如活塞的润滑油、去污剂、微生物和滤纸等。要根据具体情况加以消除，提高测定结果的准确度。,2020/6/3,光学分析仪器培训,62,荧光分光光度法,7、荧光分析中注意事项,：,7.3、温度对荧光的影响温度对溶液的荧光强度有着明显的影响。一般来说，荧光随温度降低而增强，其原因在于溶液温度下降过程中，介质的粘度逐渐增大，荧光物质分子与溶剂分子的碰撞也随之而减小的缘故。溶剂中如有淬灭剂存在，温度对荧光强度的影响将会变得更杂。,2020/6/3,光学分析仪器培训,63,荧光分光光度法,7、荧光分析中注意事项,：,7.4、荧光的猝灭现象在荧光的定量分析中说的猝灭主要是指荧光熄灭中的自吸收和自熄灭所引起的,既当荧光物质浓度较大时,常会发生自熄灭现象使荧光强度降低。,2020/6/3,光学分析仪器培训,64,荧光分光光度法,7、荧光分析中注意事项,：,7.4、荧光的猝灭现象这可能是由于激发态分子之间的碰撞引起的能量损失,当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时,荧光被溶液中处于基态的分子吸收,使发出的荧光强度降低。出现了当荧光物质浓度达到一定值时随着浓度的增加荧光强度反而降低的现象。在分析工作中我们一定要注意。以免影响分析结果。,2020/6/3,光学分析仪器培训,65,荧光分光光度法,7、荧光分析中注意事项,：,7.5、光散射光散射常常关系到一个实验操作的灵敏度和再现性。在荧光分析中，可能遇到的光散射主要有三种，即丁铎尔散射、瑞利散射和拉曼散射。在实际测定工作中，对于不同的样品，各种因素的影响程度是不一样的，所以要分清主次并找出最适条件来克服其影响，才能得到满意的结果。,2020/6/3,光学分析仪器培训,66,荧光分光光度法,8、荧光分光光度计操作,：,8.1、样品的保鲜、实验方法和计算公式的理解问题这对生物样品分析所产生的结果的准确度尤为重