DNA重组的技术基本工具PPT课件VIP

.,1,基因工程,专题1,莲花中学刘石根2014.2.1714/19,.,2,每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是的！,通用,.,3,基因工程的产物,.,4,什么叫基因工程？,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。,基因工程的概念,补充：对基因工程概念的理解别名：基因拼接技术，DNA重组技术操作环境：生物体外操作对象：基因操作水平：DNA分子水平基本过程：剪切拼接导入表达结果：人类需要的基因产物,基因工程得以实现的理论基础：（1）所有生物DNA的化学组成和结构相同。（为不同种生物DNA拼接成功提供物质基础）（2）所有生物共用一套遗传密码子。（为某生物的基因能够在其他生物细胞内正常指导蛋白质合成提供可能。）,都是以4种脱氧核苷酸为基本单位,都是双螺旋结构,.,7,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,.,8,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生伴胞晶体,转基因棉花有抗虫特性,.,9,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,.,10,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,.,11,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.主要来源：种类与命名：作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：,识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,Goon,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,.,12,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,Goback,.,13,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）,大肠杆菌（EscherichiacoliR）,Goback,练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,.,14,磷酸二酯键,H2O+,.,15,DNA分子,切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,补充：脱氧核苷酸中脱氧核糖的五个碳原子和氧原子的定位。,O,O,图12,.,17,限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,限制性内切酶与DNA水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,Goback,.,18,限制酶的识别序列：,能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。,Goback,.,19,EcoR,黏性末端,黏性末端,Goback,.,20,EcoR,黏性末端,黏性末端,重复演示,Goback,.,21,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,.,22,Sma,平末端平末端,.,23,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,EcoR,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTCCTTAAG,酶切,GAATTCCTTAAG,同一种,.,24,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,.,25,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,.,26,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,.,27,二、“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,.,28,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,.,29,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体：细菌的质粒噬菌体衍生物或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,.,30,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,.,31,.,32,思考与探究P7（2）,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,.,33,3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究P7,.,34,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究P7,.,35,1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶,A,课堂练习,.,36,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,课堂练习,.,37,3.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,课堂练习,.,38,再见,.,39,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,.,40,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,.,41,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,.,42,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,.,43,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,.,44,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,.,45,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,克里克等提出中心法则,.,46,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,.,47,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明,.,48,资料分析,位于费城托马斯杰斐逊大学的希拉里和她的同事成功地将人体狂犬病抗体的DNA译码移入烟草作物中。转基因烟草作物可以产生一种人体蛋白质，而这种物质能抗击致命性的狂犬病病毒。,.,49,此转基因实验实现了哪种生物的哪些性状在另外哪种生物中表达？性状的表达与我们从前学过的什么过程有关？要实现药物基因在烟草中的表达，要提前做哪些关键工作?,.,50,DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）限制性内切酶DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”