凝胶过滤层析分离蛋白质实验中三种过滤介质分离效果的比较

凝胶过滤层析分离蛋白质实验中三种 过滤介质分离效果的比较 杨歌德,姜玉梅,周宏博 (哈尔滨医科大学 生化教研室,黑龙江 哈尔滨150086) 摘要 目的 探讨凝胶过滤层析分离蛋白质的最佳实验效果。方法 分别采用不同规格的凝胶过滤层析介质 Sephadex G250、G275、G2100 ,通过凝胶过滤层析法分离已知分子量的混合蛋白质。结果 混合样品得到分离,呈现三 组分离样品的层析图。结论 从大分子物质中除去小分子物质时应选用交联度大的介质G250。进行中等蛋白质 分离时,选用G275较为合适。将小分子物质浓缩而除去大分子物质时,应选用交联度小的介质,如G2100或G2200。 关键词 凝胶过滤层析;葡聚糖凝胶;洗脱液;蛋白质 中图分类号 R - 331 文献标识码 A 文章编号 1000 - 1905(2002)03 - 0242 - 02 The observation of separating effects on three kinds of gel2filtration chromatography media to separate the protein mixture Y ANG Ge2de ,JIANG Yu2mei ,ZHOU Hong2bo (Department of Biochemistry and Molecular Biology,Harbin Medical University,Harbin150086 ,China) Abstract: Objective T o find out the optimal condition for separation of the protein mixture by gel2filtration chromatography. Methods Separated the protein mixture of which known molecular relative weight by gel2fil2 tration chromatography in sephadex G250 ,G275 and G2100. Results The protein mixture were separated suc2 cessful lyby gel2filtration chromatography and the chromatogram of three separated samples were presented clearly. Conclusion Sephadex G250 are suitable for purifying the large molecule protein ,G275 for the medium molecule protein ,G2100 and G2200 for the small molecule protein. Key words: gel2filtration chromatography;glucosan;eluant ;protein 收稿日期 2001 - 11 - 14;修订日期 2002 - 01 - 08 作者简介杨歌德(1951 - ) ,男,黑龙江哈尔滨人,高级实验师。 凝胶过滤层析法又称凝胶排阻层析或分子筛层 析,是60年代初发展起来的一种简便而有效的液相 柱层色谱技术。利用某些化学惰性的多孔网状结构 的物质(凝胶)为填料,通过洗脱液的连续洗脱,使混 合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。凝 胶过滤层析所需设备简单、 操作方便、 分离迅速,不 影响样品的生物活性优点,广泛应用于大分子物质 的分离纯化,也应用于蛋白质去盐及分子量的测 定 1 。我们选用不同规格的葡聚糖凝胶,商品名为 “Sephadex”G250、G275、G2100为填料,以分子量不同 的牛血清白蛋白、 溶菌酶为样品,通过凝胶过滤层 析,达到分离目的。为凝胶过滤层析分离蛋白质的 应用提供了可靠的实验数据。 1 材料与方法 111 材料 11111 试剂:Sephadex G250、G275、G2 100 ( 上海化学 试剂进口分装厂 ) ; 牛血清白蛋白、 溶菌酶;洗脱液: 0.05molL pH7.5 Tris2HCl缓冲液。 11112 仪器: HD28825AI核酸2蛋白检测仪;XWT2S 台式记录仪;部分收集器;玻璃层析柱(1. 5cm 50cm)。 112 方法 取葡聚糖凝胶G250 10g溶于300ml Tris2HCl缓 冲液中,浸泡6h以上,使之充分溶涨。将溶涨后的 凝胶溶液倒入层析柱中,约需60min ,凝胶可完全平 衡。此时柱床高度应达到45cm。需注意在此平衡 过程中始终保持液体高于凝胶表面,防止空气进入。 打开核酸2蛋白检测仪,于280nm波长处检测,加入 242 第36卷 第3期 2002年6月 哈尔滨医科大学学报 JOURNAL OF HARBIN MEDICAL UNIVERSITY Vol.36 ,No.3 Jun. ,2002 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. tris2HCl洗脱液连续洗脱约60min ,待记录仪基线平 稳后注意加入样品。分别称取牛血清白蛋白、 溶菌 酶各6.0mg共溶于1ml洗脱液中,待液面降至凝胶 表面1mm处时,将样品加入。样品进入凝胶后,加 入洗脱液高于凝胶表面34cm后连续洗脱,流速为 25滴 分。收集分离液,观察记录仪出现两个峰及基 线平稳后关机。Sephadex G275、G2100操作同上。 2 结果 211 通过凝胶过滤层析后,混合物样品得到分离。 凝胶过滤层析介质为葡聚糖凝胶G250。展现出两 个层析峰,第一个峰由牛血清白蛋白产生,第二个峰 由溶菌酶产生(见图 1) 。 212 凝胶过滤层析介质为葡聚糖凝胶G275。展现 出两个层析峰,第一个峰由牛血清白蛋白产生,第二 个峰由溶菌酶产生(见图 2) 。 213 凝胶过滤层析介质为葡聚糖凝胶G2100。展现 出两个层析峰,第一个峰由牛血清白蛋白产生,第二 个峰由溶菌酶产生(见图 3) 。 图1 Sephadex G250分离样品的层析图 图2 Sephadex G275分离样品的层析图 图3 Sephadex G2100分离样品的层析图 以上3个结果均显示出混合样品经凝胶过滤层 析后分别产生两个层析峰。但是波峰形状不同,即 分离效果有所区别。 3 讨论 凝胶层析主要根据被测样品分子量的差异,在 固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的目的。分 子量大的物质随流动相移动速度较快,先流出层析 床,并在记录仪上出现层析峰。反之,分子量小的物 质移动速度较慢,后出现层析峰 2 。本次实验样品 牛血清白蛋白,分子量为67 000 ;溶菌酶分子量 13 930;故先后出现了两个不同的层析峰。实验中 选用了三种不同规格的凝胶过滤层析介质,且分离 效果有所差异。Sephadex G250筛分范围(分子量)是 1 50030 000 ;G275是3 00080 000 ;G2100是4 000 150 000 3 。根据分离样品的分子量范围,G275、G2 100都在筛分范围内,因此,选择上述两种介质是较 为适宜的。从图1、2、3可见,三次层析都使测定样 品达到了分离的目的。但是通过图2可见,G275的 分离效果是最理想的。而且交联度较大的介质更经 济实用。一般要从大分子物质中除去小分子物质 时,例如从蛋白质溶液中去盐或除去氨基酸,可选用 交联度大的介质如G250。这样易于装柱,而且流速 较快缩短分离时间。图1显示了这种效果。反之, 如欲将小分子物质浓缩而除去大分子,应选用交联 度小的介质,如G2100或G2200。因为交联度小,孔 隙大,可避免因吸附作用而使氨基酸扩散。图3显 示了这种效果。层析图的横坐标以时间(体积)表 示,纵坐标以物质浓度表示。样品组分通过层析柱 出现峰所需的时间称为保留时间(ta)。保留时间与 流动相流速的乘积为保留体积(Va)。ta与Va均决 定于样品的性质。因此根据层析峰的位置可以定 性,根据峰高或峰面积可以定量。鉴于凝胶层析法 的高分离率、 高灵敏度及操作简单,保持样品的生物 活性等优点,这种方法已广泛应用于大分子物质的 去盐、 溶液的浓缩、 分离提纯及分子量测定。 参考文献 1 方福德,周吕,丁濂,等.现代医学实验技巧全书M.北京:北 京医科大学中国协和医科大学联合出版社,19951493. 2 陈惠黎.生物化学检验技术M.北京: