农药残留快速检测

农药残留快速检测新技术的研究进展农药残留的快速检测方法对食品安全和环境保护具有重要意义。摘要：综述了各种农产品农药残留检测新技术，简要介绍了近年来的一些新技术和进展，并总结了农药残留检测技术的发展方向。关键词：农药残留；检测技术；酶抑制；免疫分析；生物传感器介绍8农药在提高作物产量和保证人类食物供应方面做出了巨大贡献。然而，由于农药的过度使用和滥用，食品中农药残留对人体健康的负面影响越来越明显。人类食用被农药污染的蔬菜后，残留的农药会在人体内积累或富集，当浓缩到一定浓度时，会引起急性或慢性中毒。因此，迫切需要开发一种快速、可靠、灵敏的方法来分析食品和蔬菜中的农药残留。农药残留分析是一种复杂混合物中痕量成分的分析技术，要求操作方法精细、灵敏度高、特异性强。由于各种蔬菜食品样品成分复杂，不同农药品种的理化性质差异较大，没有一种多组分残留分析方法能够涵盖所有农药品种。此外，大多数农药残留的检测方法主要是仪器分析，采用高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱、气相色谱、液相色谱和质谱等。针对传统样品前处理中样品提取单一、净化时间长、有毒溶剂消耗量大的问题，美国农业部农业研究服务中心于2002年首次公布了一种快速、简便、廉价、有效、耐用和安全的农药多残留检测方法(QuEChERS)。随后，这种多种农药残留的快速检测技术得到了不断的发展和完善，2-3，并已广泛应用于蔬菜、水果等食品中农药残留的快速检测。使用的检测设备包括液相色谱-质谱、UPLC-质谱/质谱等。除了气相色谱-质谱之外，鉴于常规检测需要昂贵、笨重的设备，需要熟练的专业技术人员操作，取样检测只能在实验室进行，难以满足现场快速检测样品的要求。各国科技工作者也运用新的原理和技术，努力研究和开发一系列特异性强、灵敏度高、方便、快速、准确、安全、简便、廉价的新型快速检测方法。由于农药种类繁多、化学结构和性质不同、待测成分复杂，以及高效、低毒、低残留农药品种的不断涌现，农产品中的残留非常低，使得直接测定非常困难。因此，有必要对样品预处理技术、分析检测技术和快速检测技术进行改进、发展和研究。2.农药残留快速检测技术近年来，出现了大量的农药残留快速分析方法，如酶抑制法、免疫分析法、生物传感器技术、生物测定技术、分子印迹技术等。2.1酶抑制方法酶抑制法使用有机磷和氨基甲酸酯类农药来特异性抑制昆虫中枢和外周神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，导致乙酰胆碱在神经传导介质中积累，影响正常传导，并使昆虫中毒致死。乙酰胆碱酯酶与样品反应。如果样品中没有农药残留或残留量很小，乙酰胆碱酯酶的活性不会受到抑制。相反，如果农药残留量相对较高，乙酰胆碱酯酶的活性就会被农药抑制。有机磷或氨基甲酸酯类农药残留的存在与否可通过向酶反应试验中添加底物和显色剂来判断，以观察颜色的变化或测量特定化合物反应的物理和化学信号的变化。目前，根据酶抑制原理设计的农药残留检测方法主要有快速检测卡法(纸片法)、比色法免疫分析是一种利用抗原和抗体的特异性结合反应来检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法。)。抗原是一种能引起免疫反应的分子。这是形成特异性免疫反应的必要条件。一个完整的抗原应该包括两个基本属性：一是免疫原性；第二是反应性(也称为抗原性或免疫反应性)。具有这两种特性的物质是完全抗原，只有反应性的物质被称为半抗原。杀虫剂是典型的半抗原。它们只有反应性，但没有免疫原性，不能诱导抗体产生。只有将它们与大分子蛋白质载体结合，才能刺激人体免疫系统产生抗体。抗原和抗体的制备是免疫分析的关键和基础步骤。当制备抗原时，如果农药分子本身带有用于偶联的活性官能团(例如氨基、羧基等)。)，农药分子可以直接与蛋白质载体偶联，否则，农药分子必须被衍生化，偶联反应的活性官能团连接起来合成人工抗原。有许多因素直接影响高质量人工抗原的制备，例如合适中间体的选择、活性官能团引入位点的选择、半抗原产物的分离、间隔臂的长度以及半抗原与载体分子的偶联比7。制备抗体的方法主要有三种：动物免疫(多克隆抗体)、杂交瘤(单克隆抗体)技术和重组抗体技术。根据标记物的不同，目前农药残留分析有4种传统的免疫分析方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法/酶联免疫分析法、荧光免疫分析法(FIA/PFIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)。酶联免疫吸附法是最常用的农药残留检测方法。2.2.1放射免疫分析放射免疫测定法是一种利用放射性同位素作为标记抗原或抗体，用射线探测器或液体闪烁计数器测量射线或射线的放射性强度来测量抗体或抗原的量的技术。许等8建立了用3H标记的莠去津向土壤中添加莠去津的放射免疫分析方法。沙土和壤土的回收率分别为85.7%-95.0%和86.9%-92.1%。这表明该方法为土壤中莠去津残留的快速检测提供了理论依据。胡等9建立了用14C-克百威测定克百威的放射免疫方法。该方法的最小检测量为0.175ng/ml，线性范围为0.2564000.0ng/ml。在线性检测范围内，不同克百威浓度的蔬菜样品批内和批间的变异系数均小于10%，白菜样品的实验回收率为93.0% 104.0%，变异系数为4.3% 11.5%。该方法用于蔬菜中克百威残留量的测定是可行和可靠的。尽管放射免疫分析非常敏感，但它需要昂贵的计数器，并且存在辐射污染的问题。因此，它仅限于农药残留分析，并逐渐被其他免疫分析方法所取代。2.2.2酶免疫测定/酶联免疫吸附测定(EIA/酶联免疫吸附测定)环境影响评价/酶联免疫吸附法的基本原理与放射免疫分析法相同。抗原或抗体的一部分结合到某一固体载体的表面，并保持其免疫活性，因此抗原或抗体的另一部分与某一酶连接，形成酶标记的抗原或抗体，其既保持其免疫原性又保持酶活性。在测量过程中，待测抗原或抗体和酶标抗原或抗体按照不同的步骤与固体载体表面的抗原或抗体反应。通过洗涤方法将固相载体表面形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，最终与固相载体结合的酶的量与样品中待检测物质的量成一定比例。加入酶反应底物后，酶催化底物变成有色产物。由于产品的量与样品中待测物质的量直接相关，因此可以根据颜色的深度进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，反应效果可以大大放大，从而使测定方法达到更高的灵敏度。EIA/ELISA具有较高的特异性和灵敏度，特别适用于农药残留分析。自1983年以来，它发展迅速。由于避免使用放射性物质和低检测限(最低检测限达到10 -10 g/mL)，它已成为最常用的农药残留检测方法。它与气相色谱和液相色谱一起被美国化学学会(AOAC)列为农药残留检测的三大支柱技术。最初的农药残留分析的环境影响评价/酶联免疫吸附试验研究主要集中在特定的农药，即单目标分析10-11。迄今为止，已有100多种农药可用于单残留检测。涉及的杀虫剂不仅包括杀虫剂、杀真菌剂、除草剂和杀鼠剂，还包括植物生长调节剂。农药品种包括有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、三嗪等传统农药，以及苏云金芽孢杆菌、阿维菌素、伊维菌素和多杀菌素等其他生物农药。尽管目前国内外大多数农药单残留分析仍处于实验室研究和开发阶段，但为40多种农药开发的商用农药单残留分析试剂盒也在国外销售。例如，Watanabe等人12开发并生产了一种商业免疫测定试剂盒，用于直接测定果汁中的杀虫剂吡虫啉。2.2.3荧光免疫分析(国际汽联或PFIA)荧光免疫分析技术的基本原理是用荧光标记抗原，然后用标记的荧光抗原与待测农药和相应的抗体竞争结合，检测溶液中游离荧光标记物的含量。由于不需要分离和酶的开发步骤，流动注射分析的时间比酶联免疫吸附法短。传统的免疫荧光技术如荧光抗体检测、吖啶橙免疫荧光、FITC-SPA检测主要依靠人工操作，效率较低，测定结果在一定程度上受到主观因素的影响。近年来，荧光激活细胞分类和时间分辨荧光免疫分析等新方法已经建立。库恩斯等13早在1941年就合成了荧光黄异氰酸酯(FIC)，它能有效地标记抗体球蛋白而不破坏抗体的活性，但标记困难，不易推广。此后，里格斯等人14于1958年成功合成了异硫氰酸荧光素(FITC)。在不影响抗体活性的情况下，易于与免疫球蛋白形成稳定的偶联物，因此免疫荧光分析技术得到了迅速推广。经过多次改进和简化，吖啶橙免疫荧光(AOFA)和荧光素标记的蛋白After斯帕)检测方法已经出现。2.2.4化学发光免疫分析(CLIA)1977年，以色列的霍尔曼等人在化学发光的基础上，通过探索非放射性免疫诊断技术，先后将固相酶联免疫吸附测定法和化学发光测定法结合起来，建立了化学发光免疫测定法(CLIA)。CLIA具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简单、不需要非常昂贵的仪器设备等特点。CLIA有广泛的应用。它可用于检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体以及核酸探针。与放射免疫分析、荧光免疫分析(IFA)和酶免疫分析(EIA)相比，CLIA具有无辐射、标记物有效期长、自动化程度高等优点。CLIA为兽医、医疗和食品分析以及科学研究提供微量或超微量非同位素免疫分析。化学发光免疫分析根据标记物的不同可分为三类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。不同的化学发光物质具有不同的发光机理和发光特性。不同类型的化学发光免疫分析系统有不同的原理和方法，需要方法、仪器和试剂三位一体。因此，很难在研究和生产中应用它们。然而，CLIA在过去10年中发展迅速，并已应用于许多环境监测研究。然而，这种分析方法尚未广泛用于农药的快速检测。2.2生物传感器生物传感器是紧密结合生物分子识别元件(敏感元件)和信号转换元件(传感器)来检测目标化合物的分析设备。其基本原理是将待测物质与分子识别元件特异性结合，产生生化反应，将产生的生物信息转化为电信号和光信号，通过信号转换器进行定量处理，然后通过仪表放大输出，从而达到分析检测的目的。2.2.1酶传感器酶传感器是最早也是最成熟的生物传感器。在固定化酶的催化下，生物分子发生化学变化，这些变化被传感器记录下来，从而间接测量待测物体的浓度。在这些传感器中，基于乙酰胆碱酯酶(AChE)催化活性的抑制酶电极和基于有机磷水解酶(OPH)的直接酶电极已被广泛用于有机磷检测16-18。为了提高乙酰胆碱酯酶生物传感器的灵敏度并使其更有效地快速检测有机磷农药，可以选择来自鸡脑的乙酰胆碱酯酶作为这种生物传感器的酶源19。2.2.2免疫传感器免疫传感器利用抗原和抗体之间的高度特异性将抗原或抗体结合到生物敏感膜上，从而确定抗体或抗原的浓度。免疫传感器包括三个基本部分，固定有抗原或抗体基质的生物芯片部分，用于将抗体和被测对象特定组合产生的光、热、压力等物理化学信号转换成电信号的转换器部分，以及用于放大和数字化转换器产生的电信号的电子部分。农药检测中使用的转换器包括光学转换器(如折射计或反射器)、电化学转换器(电阻、电流、电压)、声波转换器和压力转换器20。徐元元等(21)根据抗体与抗原特异性反应前后电极电位的变化，制备了以金为电极的甲基对硫磷免疫传感器。该传感器的检测下限为0.085g/ml，检测范围为0.5-15 g/mL，可再生重复使用。2.3分子印迹技术分子印迹技术是一种实验制备技术，用于获得在空间结构和结合位点上完全匹配分子(通常称为模板分子)的聚合物。制备过程包括如下步骤：通过功能单体与模板分子之间的共价键或非共价键形成化合物；加入交联剂、引发剂和有机溶剂；在一定条件下聚合该化合物以生成聚合物；最后通过洗脱方法将模板分子从聚合物中去除，从而在聚合物上留下一个在空间结构和结合位点上与模板分子完全匹配的三维空腔，该三维空腔可以再次与模板分子特异性选择性结合，从而使修饰后的聚合物对模板分子22具有特异性识别功能。分子印迹聚合物是分子印迹技术的核心。国内对分子印迹聚合物23制备的研究为分子印迹技术在这些农药品种中的残留检测奠定了理论基础。分子印迹聚合物具有特定的选择性和亲和性，可以为样品中农药残留的分析提供方便。大多数研究应用于样品预处理，主要以特定的固相萃取形式21，22和膜分离24，而三嗪25是研究最多的农药。总体而言，分子印迹技术在农